黄菊花组织培养研究进展及不同植物生长调节剂配方对愈伤组织诱导情况的研究

［摘 要］ 市场需求使得组织培养技术在黄菊花量产方面起着至关重要的作用。总结菊花组织培养进展情况，并采用黄菊花茎段作为外植体建立无菌体系，研究不同植物生长调节剂配方对愈伤组织的诱导情况。试验结果表明，MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L的诱导培养基对黄菊花的培养最佳。

［关键词］ 黄菊花；黄菊花茎段；植物生长调节剂；愈伤组织诱导

［中图分类号］ S682.1 ［文献标志码］ B ［文章编号］ 1674-7909（2022）09--3

0 引言

菊花（Compositae chrysanthemum L.）为菊科菊属多年生宿根草本植物，是我国传统名花之一。笔者此次所研究的菊花为黄菊花。黄菊花具有极强的观赏价值和药用价值，因此得到了广泛栽培。黄菊花的繁殖方式多为无性繁殖。但是，黄菊花繁殖周期较长、易受到环境变化的影响，而且其基因高度纯和、遗传组成复杂，因此，在常规的育种方法中易受到染色体多倍性和非整倍性的影响，常造成自交不亲和及种子生产效率低等问题。现阶段，市场对黄菊花的需求量急剧增加，传统的培育方式已不能满足日益增长的消费需要，而利用组织培养技术可实现黄菊花迅速繁殖、大量成苗、脱毒及保持其品种特性等，在短时间内可生产大量黄菊花试管苗。选用组织培养脱毒苗进行黄菊花栽培，不仅可以增强黄菊花的适应性和抗逆性，提高其种苗品质，而且可以减少在栽培生长过程中对农药的使用，这对于生态环境的保护具有非常重要的意义。目前，黄菊花组织培养技术应用广泛，但在培养过程中依然存在内生菌、褐变、试管苗玻璃化及生根难等问题，需要相关研究人员进行深入研究。

1 黄菊花组织培养外植体及培养条件的选择

1.1 外植体的选择

植物细胞具有全能性，因此，黄菊花各部分组织均有一定的分化能力。现阶段，黄菊花组织培养中多选用带芽的菊花茎段和节间中段作为外植体。因为带芽的茎段更容易成活且生长速度快，易直接从芽生长成幼苗；而以节间中段为外植体时，则需要先经过脱分化形成愈伤组织，然后再分化形成幼苗。黄菊花茎段上的侧芽在组织培养过程中直接发育成愈伤组织再分化形成丛芽，此过程不易观察，但若使用的植物生长调节剂质量浓度较高，侧芽则会明显分化出细胞团状愈伤组织；而节间中段在组织培养过程中脱分化、再分化过程明显，且成功率高。但石虹梅等［1］研究发现，部分茎段在培养14 d后易出现褐化死亡现象。邵冰洁等［2］用小滨菊的茎段为外植体在70%酒精中浸泡15 s，在4%次氯酸钠溶液中再浸泡5 min，消毒效果较好，无菌率超过85%；同时使用质量浓度为0.5 mg/L的细胞分裂素6-BA加质量浓度为0.5 mg/L的生长素NAA开始外植体启动培育，启动率可达到 80%，研究结果与姜桂侠等［3］研究结果相似。菊花叶片同样可以作为外植体，叶龄是决定组织培养效果的重要因素之一，如果叶龄过老会导致再生困难，叶龄太小则容易在培养后坏死。因此，常选择植株上端两三片幼龄壮叶作为培养材料，以利于组织培养的顺利进行。丁晓霞［4］选取春季幼嫩茎段或新生叶片为外植体有相似发现；但高亦珂［5］等以地被菊和传统菊花的叶片和茎段为外植体对比，在相同条件下以茎段为外植体的诱导愈伤率高于叶片作为外植体。同时，裴红美［6］等也对瓜叶菊小丑系列品种叶片和叶柄为外植体进行对比，发现菊花叶片的再生能力优于叶柄，但在快繁中并不建议采用叶片作为外植体，因为叶片背生绒毛，灭菌消毒效果不好。大量研究者在进行重复试验中发现，菊花叶片的愈伤组织分化形成丛芽的成功率非常低，并且愈伤组织容易长到一定程度后不再进行分化，甚至不继续生长，最后死亡。因此，笔者采用黄菊花茎段作为外植体建立无菌培养体系。一般来说，选取黄菊花茎尖顶端圆锥区长度小于0.1 mm的分生组织进行培养效果最好，但目前其实际操作较为困难并且不易成活。

1.2 菊花组织培养条件的选择

就培养的外部因素来看，温度、湿度、光照、pH值等均会影响外植体的脱分化及再分化。赵维萍等［7］发现，菊花组织培养在光照时间12 h/d与黑暗培养12 h/d相结合、光照度在2 000～3 000 lx、温度在25 ℃左右条件下较为适宜；相对湿度在80%左右、培养基pH值为5.8～6.0时较利于组织培养苗的生长；不同菊花外植体用到的原代、继代、生根培养基不同，但均以MS培养基为基础，只是植物生长调节剂种类、质量浓度有差异。不同植物生长调节剂配比对愈伤组织的诱导、分化、增殖、生根起着不同的作用。

1.3 原代培养基

利用菊花茎段为外植体时，李翠香等［8］和苏宝玲等［9］研究所用的细胞分裂素6-BA质量浓度均为2.0 mg/L，但前者所用TK质量浓度为0.5 mg/L，后者所用NAA质量浓度为0.2 mg/L，均为其试验中最佳的愈伤组织诱导培养基。汤春梅［10］采用菊花满天星品种的茎段作为外植体，选择MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L的培养基作为最佳的诱导培养基。邱美欢［11］等用神马菊茎段作为外植体时，所用的最佳诱导培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。上述研究中表明，针对不同品种的菊花可能需要不同的植物生长调节剂及质量浓度。

1.4 继代培养基

袁成志等［12］用菊花叶片作为外植体，最佳丛生芽继代培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L；李晓亮等［13］用盆栽菊花香草水晶的茎尖作为外植体，最佳培养基为MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.01 mg/L；齐向英等［14］用含有腋芽的茎段作为外植体，所用的最佳继代培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L+TDZ 0.01 mg/L。由于菊花品种不同、外植体不同，培养过程中所用植物生长调节剂种类和质量浓度配比也会随之改变，继代培养会使外植体的丛芽进一步壮大。

1.5 生根培养基

龚明霞等［15］用黄绣球菊花茎段作为外植体时所用最佳生根培养基为1/2 MS+NAA 0.2 mg/L。大量文献显示，生根培养均未用到6-BA，NAA生长素更易诱导不定根生成且大部分用到的MS均为1/2。综上所述，生根培养基以1/2 MS+NAA 0.5 mg/L效果最佳。

笔者此试验研究以黄菊花茎段作为外植体进行组织培养时，其在不同浓度6-BA条件下愈伤组织的生长情况。

2 不同质量浓度植物生长调节剂配比对愈伤组织的诱导试验

2.1 材料与方法

2.1.1 材料与设备。试验材料为黄菊花幼嫩茎段，取自保定市花鸟鱼虫花卉市场。试验器具主要有高压蒸汽灭菌锅、光照培养箱、无菌操作台、培养瓶、量筒、烧杯、酒精灯、培养皿、pH试纸等。

2.1.2 试验过程

2.1.2.1 外植体准备。将获取的菊花幼苗在清水中清洗数次，剪去叶片截取幼嫩茎段，再冲洗三四次后晾干。在超净工作台上，用75%乙醇浸泡30～60 s，再用无菌水冲洗1～3次，放入0.15%升汞（84消毒液）溶液中消毒5 min，用无菌水冲洗3～5次（每次3 min），灭菌滤纸上滤干水分。将菊花茎段切成长度约为0.5 cm的小段，无菌水再次冲洗一两次，取出放置在灭菌的4层纱布或滤纸上滤干水分，准备接种。

2.1.2.2 培养基准备。试验所用丛芽诱导培养基共有3种，分别为A：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L，B：MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L，C：MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L。

丛芽继代培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，生根培养基为1/2 MS+NAA 0.5 mg/L。外界环境：光照度2 000～3 000 lx，光照培养时间为12 h/d，黑暗培养为12 h/d，温度为24～26 ℃，pH值为5.6～5.8。

2.1.2.3 接种试验。接种A、B、C原代培养基各72瓶。将长度为0.5 cm的菊花茎段外植体在无菌条件下接种到培养基上，并给予诱导分化培养。外植体在诱导培养基中培养10 d、15 d、30 d，观察愈伤组织形态、生长状况，并记录汇总数据。

愈伤组织诱导率=（成功诱导出愈伤组织的外

植体数/接种外植体的总数）×100%（1）

成活率=（成活植株数/总的接种植株数）×100%（2）

污染率=（污染的外植体数/接种外植体的总数）×100%（3）

2.2 结果与分析

接种A、B、C原代培养基各72瓶接种后，除去褐化、玻璃化、内生菌污染，补救后得到A种培养基40瓶，B种培养基长势很好得到48瓶，C种培养基补救后得到24瓶。用黄菊花茎段作为外植体进行组织培养时，其在不同质量浓度6-BA条件下愈伤组织的生长情况见表1。其中，接种培养数是成功诱导出愈伤组织的外植体数。

由表1数据可知，试验中MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L培养基对黄菊花茎段愈伤组织的诱导状况最佳。

2.3 结论与讨论

试验中发现，黄菊花茎段在培养中褐化问题较严重，外植体在生长过程中会产生褐化物并向外扩散，使培养基产生褐变造成培养失败，严重影响外植体的脱分化和再分化。究其原因，可能是黄菊花体内含有较多的酚类化合物，在多酚氧化酶的作用下，酚类化合物会氧化形成棕褐色的醌类和水酚类物质，并且会在酪氨酸酶等酶的作用下使外植体的蛋白质聚合导致生长停顿，继而走向死亡。

目前，种植者可通过以下方法进行改善：①选择适宜外植体，菊花茎尖有较强的分生能力，处于旺盛生长状态，可减少褐变；②缩短转瓶时间；③在培养基中加入抗氧化剂，如维生素C、柠檬酸、硫代硫酸钠、二硫苏糖醇及谷胱甘肽等；④试验中常用0.01%～0.10%活性炭吸附酚类氧化物，可减缓培养物褐变程度。

3 菊花培养目前存在的问题及展望

目前，菊花转基因育种多致力于改变花色、花形、花期、株形和抗病虫等方面，但外源目的基因在黄菊花中的表达不稳定、转化效率低，还有待深入研究。菊花的有性杂交和芽变选种已经获得了较好的效果，但是方法尚不够成熟。不同菊花品种对胚性愈伤组织诱导的影响较大，如玉人面、铺地金、紫妍、杭白菊等黄绿色菊花品种胚性愈伤组织的诱导和间接体细胞胚发生的能力较强，花朵繁密的茶用菊花品种次之，植株较大的切花菊花品种间接体细胞胚发生的能力最弱。笔者采取的菊花组织培养技术由于染色体发生显著改变和染色体反常，直接或间接地导致组织培养中出现变异问题，会降低黄菊花原有价值，这也是未来需要关注的问题之一。

在众多方式中，若想短时间内获得成千上万数量的菊花苗，组织培养是最优的方式之一，同时可结合脱毒技术解决病虫害问题。还可通过加强高校、研究院、企业之间的合作，使菊花组织培养技术得到进一步的改进，提高试验的脱毒效果、繁殖效率及可重复性，从而实现菊花苗木快速高效优质的大量繁殖。

参考文献：

［1］石虹梅，俞明月.“菊花组织培养”试验选取不同部位为外植体的结果比较［J］.生物学通报，2017（1）：57-58.

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［3］姜桂侠，伍凯.“菊花的组织培养”的实践探索［J］.教育与装备研究，2019（8）：27-29.

［4］丁晓霞.菊花组织再生体系研究进展［J］.辽宁林业科技，2018（4）：64-68.

［5］高亦珂，赵勃，丁国勋，等.菊花茎叶外植体再生体系的研究［J］.北京林业大学学报，2001（1）：32-33.

［6］裴红美，韩科厅，胡可，等.瓜叶菊‘小丑’系列品种再生体系的研究［J］.北京林业大学学报，2011（1）：108-114.

［7］赵维萍，王艳琪，刘洋，等.药用菊花组织培养技术研究进展［J］.安徽农学通报，2019（12）：36-38.

［8］李翠香，胡元森，姜孝先，等.菊花愈伤组织诱导的影响因素研究［J］.北方园艺，2013（9）：132-133.

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