筛选Toll样受体激动剂用于羊抗人载脂蛋白A1抗体的制备

摘要 为了筛选能够提高羊免疫应答的Toll样受体激动剂，设计针对羊 TLR1～TLR10 基因序列的引物，采用PCR方法检测羊体内Toll样受体的表达情况。然后，将人载脂蛋白A1（ApoA1）和HMT13佐剂配伍不同的TLR1～TLR9样受体激动剂，分组免疫湖羊后采集血样，并通过琼脂扩散试验检测抗体效价。结果表明：在湖羊的血液中均可检测到 TLR1～TLR10 的特异性目的片段。经过3、5、7次免疫后，添加TLR3激动剂的组效价最高，说明TLR3激动剂Ploy（I∶C）免疫增强效果最佳，可作为提高羊疫苗免疫的候选激动剂。

关键词 Toll样受体；激动剂；湖羊；ApoA1；免疫应答

中图分类号 S 859.79+7  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2025）01-0098-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.01.020

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Selecting Toll-like Receptor Agonists for the Preparation of Sheep Anti-human Apolipoprotein A1 Antibody

DENG Bi-hua   ZHOU Yu-jie ³， YIN Wen-zhu2 et al

（1.Zhenjiang Institute of Agricultural Sciences in Hilly Areas of Jiangsu Province， Zhenjiang， Jiangsu 212400;2.Institute of Veterinary Immunology &Engineering， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing， Jiangsu 210014;3.College of Veterinary Medicine， Nanjing Agricultural University，Nanjing， Jiangsu 210095）

Abstract In order to select Toll-like agonists that can enhance the immune response in sheep， PCR method was used to design the primers for the gene sequences of  TLR1-TLR10  for sheep， and detect the expression of Toll-like receptors in sheep.Subsequently， human apolipoprotein A1 （ApoA1） and HMT13 adjuvant were combined with various commercialized TLR1-TLR9 agonists. Post immunization of Hu Sheep in different groups， blood samples were collected and antibody titers were detected by using agar diffusion test. The results indicated the specific target fragments of  TLR1-TLR10  were detected in the blood of Hu Sheep. After 3， 5， and 7 rounds of immunization，the titer in TLR3 agonist group was the highest， which suggested that the TLR3 agonist Poly（I∶C） exhibited the best immuno-enhancing effect， so it could be used as a candidate agonist for improving the vaccine immunogenicity in sheep.

Key words Toll-like receptors;Agonist;Hu Sheep;ApoA1;Immune response

基金项目 江苏省自主创新项目（SX（22）3041）；镇江市科技计划项目（SH2022016）；句容市科技项目（ZA42107）。

作者简介 邓碧华（1981—），男，江苏无锡人，副研究员，硕士，从事疫苗佐剂研究。*通信作者，副研究员，从事畜禽高效养殖研究。

动物机体内存在先天性免疫应答和适应性免疫应答2种免疫应答方式。这2种免疫应答帮助机体抵御微生物感染和维持机体稳态^［1-2］。先天性免疫系统主要通过模式识别受体感知病原体相关的分子模式（PAMPs）来识别入侵的病原体，为机体提供第一道免疫防线^［3］。Toll样受体（TLRs）识别PAMPs激活下游信号通路，从而诱导趋化因子、细胞因子和共刺激分子的表达来参与机体的免疫反应。TLRs信号通路可通过激活多种信号转导途径来激活补体产生免疫^［4-5］，也可激活树突状细胞分泌大量Ⅰ型干扰素^［6］，此外还可激活专职性抗原提呈细胞（如树突状细胞、单核/巨噬细胞、B细胞等）呈递抗原给T细胞，进而激活适应性免疫应答^［7］。每种TLR都有自己的特定组织定位和下游基因信号通路，TLR激动剂可以与其他TLRs或替代佐剂组合，产生具有协同或调节作用的组合佐剂。

人载脂蛋白A1（ApoA1）在肝及肠黏膜中合成，主要存在于高密度脂蛋白中。ApoA1是防止动脉硬化的保护因子，与动脉粥样硬化性心血管疾病呈负相关。ApoA1是反映冠心病危险因素的重要指标^［8-9］。羊抗ApoA1抗体是用人ApoA1免疫健康羊获得免疫血清，经过亲和纯化后获得抗体。羊抗ApoA1抗体是ApoA1检测试剂的关键核心原料。免疫过程中选择合适的免疫增强剂，有助于提高羊抗ApoA1抗体效价，降低抗体的制备成本。TLR激动剂作为免疫增强物质，是人和动物免疫研究的热点。

目前已鉴定的TLRs有10～15种，其中人类有10种，而TLR1～TLR9普遍存在于鱼类到人类的各种脊椎动物中^［10］。然而，关于羊与Toll样受体关系的研究较少。笔者检测羊Toll样受体在体内的表达，筛选适合羊免疫应答的TLR激动剂，以期为提高羊的疫苗免疫和抗体制备提供新的研究思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物。

湖羊（50只、成年、健康、体重35 kg左右），由徐州苏羊羊业有限公司提供。

1.1.2 主要试剂。

HMT13佐剂，由江苏省农业科学院动物免疫工程研究所制备；琼脂糖，购自南京生兴生物技术有限公司；聚乙二醇（PEG），购自国药集团化学试剂有限公司；ApoA1抗体偶联亲和层析柱，购自美国GE公司；ApoA1蛋白标准品，购自上海联迈生物工程有限公司；DNA提取试剂盒、核酸染料、2× Taq  PCR MasterMix，购自天根生化科技有限公司；Toll样受体激动剂1～9，购自Sigma试剂公司。

1.2 方法

1.2.1  TLRs 基因的扩增。

1.2.1.1 引物设计与合成。

根据GenBank数据库中已有山羊或绵羊 TLRs 基因序列信息，应用SnapGene 4.2.4软件设计 TLR1～TLR10 基因特异性扩增引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 TLR1～TLR10 基因扩增引物见表1。

1.2.1.2 羊血液总DNA的提取。

在添加200 μL抗凝剂的血液中加入20 μL 蛋白酶K溶液，混匀。按照DNA提取试剂盒说明书操作，将提取的DNA收集到离心管中，于2～8 ℃下保存备用。

1.2.1.3 PCR扩增。

以提取的DNA为模版，利用合成的引物进行PCR扩增。PCR反应体系如下：2× Taq  PCR MasterMix 12.5 μL、上下游引物各1.0 μL、DNA 1.0 μL，补水至25.0 μL。使用PCR仪进行PCR扩增，PCR扩增程序如下：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，35个循环；72 ℃ 10 min。

1.2.2 ApoA1的提取与纯化。

将聚乙二醇（PEG）法沉淀血浆后得到上清液，用-20 ℃预冷乙醇沉淀、离心；沉淀物用磷酸盐缓冲液复溶后进行多次透析；采用亲和层析法，用ApoA1抗体偶联亲和层析柱，透析后的上清液多次过柱反应、洗脱、透析，并用超滤管超滤后得到ApoA1天然抗原。将纯化的蛋白样品加入SDS上样缓冲液制样，利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）方法进行分离鉴定。

1.2.3 羊血清中抗体效价的检测。

1.2.3.1 免疫分组。

将50只成年健康湖羊打上耳标标记，随机分为10组，每组5只。使用不同佐剂制备的疫苗免疫，具体分组见表2。免疫后定期采集湖羊的免后血清。动物试验在江苏省农业科学院实验动物伦理委员会的指导下开展。试验结束后，所有试验动物按照有关法律法规进行无害化处理。

1.2.3.2 琼脂扩散试验检测抗体效价。

在100 mL 8%的氯化钠溶液中加入1.0 g的优质琼脂糖，加热融化后加入终浓度001%的硫柳汞防腐，浇制凝胶板（约3 mm厚）。按六角形打孔，孔径5.0 mm、孔距3.0 mm。将血清用生理盐水进行2倍系列稀释，中央孔加入ApoA1抗原，周围孔依次加入各稀释度的羊血清。加样后置于37 ℃湿盒中孵育，若出现特异条带则判定为阳性，出现条带的最大稀释倍数即为抗体效价。定期检测免后羊血清中的抗体效价。

1.2.4 数据统计与分析。

采用GraphPad Prism 9.0 软件对试验数据进行整理，采用Two-way ANOVA对抗体效价进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 羊血液PCR检测 TLR1～TLR10 电泳结果

以提取的5个羊血液样本总DNA为模板，用合成的引物进行目的基因扩增，对PCR产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。电泳结果显示， TLR1～TLR10 均出现对应大小的特异性条带，结果见图1。

2.2 ApoA1抗原的验证

对该研究提取的ApoA1天然抗原进行检测。SDS-PAGE结果显示，提取纯化的蛋白条带单一，大小约28 ku，与目标蛋白ApoA1大小一致（图2）。

2.3 抗体检测结果

给羊分组免疫含不同TLRs激动剂的ApoA1乳剂，分别在免疫3次后10 d、免疫5次后10 d和免疫7次后10 d采血，利用琼脂扩散试剂检测抗体效价，结果发现免疫7次后10 d 3组（含TLR3激动剂）的免疫效果最佳，显著优于1组（不含TLRS激动剂）；2组（含TLR1/2激动剂）、6组（含TLR2/6激动剂）、7组（含TLR7激动剂）和9组（含TLR9激动剂）的免疫效果略优于1组；5组（含TLR5激动剂）和8组（含TLR8激动剂）的免疫效果与1组差异不显著；4组（含TLR4激动剂）的免疫效果低于1组，结果见图3。