三疣梭子蟹和口虾蛄血细胞图像流式分类分析
作者： 孔磊 陈宇翔 崔雨辰 张宁 张亦陈 刘逸尘 孙金生
摘要 ［目的］比较优化适用于多种甲壳动物血细胞分析的流式方法和分类标准。［方法］对比分析了图像流式细胞术和显微观察法在三疣梭子蟹和口虾蛄2种海产甲壳动物血细胞分类中的应用。［结果］显微观察参考可辨的胞内颗粒，从2种动物血细胞中区分出无颗粒细胞、小颗粒细胞及大颗粒细胞3种，但分类标准主观性较强，批次统计波动相对较大；流式测量以更加客观的侧向散射强度和面积测量值为标准，将血细胞清晰分为无颗粒、小颗粒、中颗粒和大颗粒细胞4类，其中无颗粒细胞占比均在30%左右，含有颗粒的细胞占比较大，总体与显微观察结果相近。从细胞大小来看，2种方法呈现出一致的分析结果，一方面从无颗粒细胞到大颗粒细胞，呈现逐渐增大的特征；另一方面，口虾蛄的各类血细胞均大于三疣梭子蟹的血细胞。［结论］2种方法评价标准既有区别又有联系，因此结果相近；在适用范围方面具有一定的互补性，流式测量能区分4类细胞，而且通量高，适合大量样本的精细分析。
关键词 三疣梭子蟹；口虾蛄；血细胞；流式细胞术；分类
中图分类号 S 917.4 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2025）01-0102-05
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.01.021
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Hemocytes Classification of Portunus trituberculatus and Oratosquilla oratoria by Imaging Flow Cytometry
KONG Lei， CHEN Yu-xiang， CUI Yu-chen et al
（College of Life Science， Tianjin Normal University/Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance， Tianjin 300387）
Abstract ［Objective］To optimize flow cytometry based methods and standards for crustacean blood cell classification. ［Method］Imaging flow cytometry and microscopic observation were compared on blood cell classification of Portunus trituberculatus and Oratosquilla oratoria . ［Result］Three cell types could be separated from both animals based on microscopic observation， which referred to the differences of distinguishable intracellular particles， but the results were fluctuated by batch. Flow cytometry， based on more objective measurement of intensity and area of side scattering， could clearly divide blood cells into four populations of non-granular hemocyte （NG）， small-granular hemocyte （SG）， intermediate-granular hemocyte （MG）， and large-granular hemocyte （LG）. According to flow cytometry measurement， about 30% were non-granular hemocytes in both animals， cells with refractive structures count for the main part of whole blood cells， which was similar to that of microscopic observation results. In terms of cell size， both methods showed the same results. On one the hand， cell size increased gradually from non-granular hemocyte to large-granular hemocyte;On the other hand， all hemocytes of Oratosquilla oratoria were larger than those in Portunus trituberculatus . ［Conclusion］Microscopic observation and flow cytometry were complementarity for each other;flow cytometry could distinguish more cell populations， was more reliable due to its objectivity， and suitable for high throughput fine analysis.
Key words Portunus trituberculatus ; Oratosquilla oratoria ;Hemocyte;Flow cytometry;Classification
基金项目 天津市应用基础与前沿技术研究计划项目（19JCYBJC29700，15JCZDJC33800）；天津市水产生态及养殖重点实验室开放基金项目（TJAE2015005）。
作者简介 孔磊（2000—），女，山东菏泽人，硕士研究生，研究方向：水生生物学。*通信作者，副教授，从事水生生物学研究。
甲壳类（Crustacea）属于节肢动物（Arthropoda）中的一个重要的亚门，大多生活在水环境内，以海水中为主，日常食用的各种虾、蟹都是其典型代表。三疣梭子蟹（ Portunus trituberculatus ）和口虾蛄（ Oratosquilla oratoria ）是软甲纲中2种经济价值较高的海产甲壳动物。前者属于十足目（Decapoda）梭子蟹科（Portunidae）梭子蟹属（ Portunus ），俗称梭子蟹、枪蟹、海蟹以及门蟹等，广泛分布在中国、日本、朝鲜、马来群岛和红海等海域［1］。后者常被称为爬虾、皮皮虾、螳螂虾等，属于口足目（Stomatopoda）虾蛄科（Squillidae）口虾蛄属（ Oratosquilla ），多沿俄罗斯、中国、日本、韩国与越南一线以及澳大利亚近海分布［2］。梭子蟹和口虾蛄味道鲜美，富含蛋白质，具有较高的营养价值和经济价值［3］。随着口虾蛄等甲壳动物人工培育技术的发展［4］，养殖甲壳动物的种类、面积和产量等也在逐渐增加，与此同时各种病害也随之而来，因此有必要对其免疫系统开展深入研究。血细胞是免疫系统的关键组分，承担大部分免疫功能，但是甲壳动物血细胞分类和功能研究尚不充分，需要从技术方法等方面予以完善。胡锦丽等［5-6］利用图像流式细胞术，以量化标准将甲壳动物血细胞清晰分为4类，并通过微球吞噬测试发现，各类细胞均具有吞噬功能，但无颗粒和小颗粒细胞是主要行使吞噬功能的细胞类群。
各类血细胞在免疫系统中扮演着重要角色，可以通过吞噬等发挥细胞免疫功能，还能够释放多种免疫因子参与体液免疫［7］。血细胞的分类与功能分析紧密相连，但是甲壳动物血细胞的类群划分尚未形成统一观点，目前多以显微观察和染色辅助为主，带有一定的主观性。笔者采用流式分析的方法，根据关键参数的测量差异对细胞类群加以区分，为更精细的功能解析提供必要参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 实验动物。
试验用三疣梭子蟹和口虾蛄购自水产市场。梭子蟹体重为（140±5）g，口虾蛄体重为（30±5）g，置于实验室循环养殖系统暂养，盐度为（30±1）‰，水温为（20±1） ℃。暂养5 d后，选择活力旺盛、体表无明显伤残的个体用于采血分析和测量。
1.1.2 试验试剂。
抗凝剂参考文献［8］配制，柠檬酸三钠30 mmol/L，氯化钠338 mmol/L，葡萄糖115 mmol/L，乙二胺四乙酸二钠10 mmol/L，pH=7.0，4%多聚甲醛固定液购自生工生物工程（上海）股份有限公司，其他试剂均为国产分析纯级。
1.1.3 试验仪器。
显微观察使用Leica公司的DM5000型荧光显微镜；流式测量使用Merck Millipore公司的FlowSight型图像流式细胞仪。
1.2 试验方法
1.2.1 细胞样品制备。
使用一次性注射器，按抗凝剂与血淋巴体积比1∶ 分别从梭子蟹和口虾蛄附肢基部抽血，迅速混匀后转入15 mL离心管，再加入等体积的4%多聚甲醛溶液，用吸头轻轻混匀，冰浴固定10 min，用PBS洗涤后重悬，4 ℃保存备用。
1.2.2 显微镜观察。
使用上述未经染色处理的血细胞悬液制作滴片，显微镜观察并照相，根据胞内可辨颗粒的数量和大小等综合差异，对血细胞进行归类和统计分析。
1.2.3 图像流式测量。
用70 μm规格细胞筛过滤前述固定、洗涤处理的细胞悬液，去除多细胞团，流式测量每个样品采集10 000个样点的数据和图像，使用IDEAS Application软件进行数据分析。
2 结果与分析
2.1 血细胞的显微观察和分类
梭子蟹和口虾蛄血细胞的形态较相似，主要为椭圆形或近圆形，部分细胞内可见明显的颗粒结构。根据细胞内颗粒的大小和数量，2种动物的血细胞均分为无颗粒细胞、小颗粒细胞和大颗粒细胞3种。无颗粒细胞以胞内没有明显可辨的颗粒为主要特征，从外部观察细胞膜较平坦，细胞核清晰易辨，核质比大，胞质较少。小颗粒细胞内多含有数量不等、大小差异显著的细碎颗粒，粒径为细胞直径的5%～10%，颗粒多分布在细胞核周围，质膜在颗粒部位有显著隆起，核质比居中。大颗粒细胞最显著的特征是胞内密集分布较大的颗粒结构，粒径为细胞直径的10%左右，大小较均匀，细胞核多被颗粒完全遮挡，质膜上紧贴颗粒的区域起伏较显著（图1）。
从2种动物血细胞大小对比来看，口虾蛄的血细胞整体大于梭子蟹，其最小的一类血细胞也略大于后者体积最大的。另一方面，从每种动物各自3类血细胞大小的对比来看，无颗粒细胞在2种甲壳动物中都属于最小的一类，而大颗粒细胞都是最大的。分类统计结果显示，2种甲壳动物血淋巴中带有颗粒的细胞占比较大，而且都以小颗粒细胞为主，分别占（47.13±7.69）%和（38.31±10.38）%，而大颗粒细胞占比则较为接近（表1）。