花生冠腐病病原菌的分离鉴定及生物学特性研究

摘要 为减少冠腐病对花生生产带来的损失，从安徽省不同花生产区采集冠腐病病株分离病原菌，对其进行致病性测定、形态鉴定和分子生物学鉴定，并对其生物学特征进行研究，室内筛选抑菌效果较好的化学药剂。结果表明，引起安徽省花生冠腐病的病原菌为黑曲霉（ Aspergillus niger ），该菌的致死温度为59 ℃（15 min），在pH 7的PDA培养基上生长最快。药剂筛选结果表明，50%多菌灵可湿性粉剂和43%戊唑醇悬浮剂效果最好；75%百菌清可湿性粉剂次之；其次是70%代森锰锌可湿性粉剂；3%甲霜恶霉灵水剂与对照无明显差异。

关键词 花生冠腐病；黑曲霉；分离鉴定；抑菌作用

中图分类号 S 435.652  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2025）01-0133-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.01.027

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Isolation and Identification of the Pathogen of Peanut Crown Rot and Its Biological Characterisitics Research

ZHU Xiao-feng，WANG Song， JIANG Tao et al

（Crop Research Institute， Anhui Academy of Agricultural Sciences/Anhui Key Laboratory of Crop Quality Improvement， Hefei， Anhui 230031）

Abstract To reduce the loss caused by peanut crown rot on peanut production， the peanut crown rot disease plants were collected from different peanut growing areas in Anhui Province. The pathogen was isolated， and the pathogenicity， morphology and molecular biology of pathogens were identified. And its biological characteristics were studied， chemical agents with better antibacterial effects indoors were screened. The results confirmed that the pathogen of peanut crown rot in Anhui Province was  Aspergillus niger ， which had a lethal temperature of 59 ℃（15 min）， and the fastest growing in the medium of pH 7. The drug screening results indicated that 50% carbendazim WP and 43% tebuconazole SC had the best inhibitory effect; 75% chlorothalonil WP followed; next was 70% mancozeb WP; 3% metalaxyl-hymexazol AC had no significant difference from the CK.

Key words Peanut crown rot; Aspergillus niger ;Isolation and identification;Fungistatic action

基金项目 财政部和农业农村部：国家现代农业产业技术体系项目（CARS-13-合肥综合试验站）；安徽省油料作物产业技术体系。

作者简介 朱晓峰（1989—），女，安徽无为人，助理研究员，博士，从事花生抗病遗传育种研究。*通信作者，研究员，硕士，从事花生种质资源鉴定和创新研究。

花生（ Arachis hypogasa  L.）是我国主要的油料和经济作物。近年在农业生产中越来越受到重视，种植面积逐年增长，2021年全国花生种植面积超过48万hm 总产超过1 830万t，再创历史新高（2022年国家统计局数据）。花生冠腐病（peanut crown rot disease）是危害花生主要土传病害之一，多在花生出苗至团棵期发生，成株期较少，是花生苗期的主要病害。该病害影响范围广泛，在我国花生各产区均有发生，对我国很多花生产区均存在潜在的威胁，尤其在山东、河南、江西、山西、福建等省已有大面积发生^［1-4］。冠腐病在花生上的危害最早于1926年被Jochem^［5］首次报道。花生冠腐病是一种世界性的土传病害，印度和美国每年因冠腐病造成的花生产量损失均在5%左右，严重的可达40%^［6］。目前已知引起花生冠腐病的病原菌主要是黑曲霉^［5-9］，但不同地理区域花生冠腐病的病原菌是否存在差异还有待研究。冠腐病在国内花生上危害较小，一般不造成大的经济损失，国内学者并未进行系统的研究。近年来，受农业结构调整、秸秆还田等因素影响，该病害发生明显有加重的趋势，才逐渐受到国内学者的重视。

冠腐病在安徽省花生主产区固镇、泗县、肥东等地常有发生。安徽省夏花生苗期常出现高温高湿天气，适合冠腐病发生。一旦发病，会造成植株枯萎、缺苗断垄的现象，严重影响花生的产量和品质。为明确安徽省花生冠腐病的病原菌，笔者对安徽省花生产区的冠腐病株进行多年多点采样，并进行分离鉴定，经过形态学及分子鉴定，证实该病害病原菌为黑曲霉（ Aspergillus niger ）。同时，为筛选防治花生冠腐病的药剂，选择5种常用的杀菌剂进行室内药剂对比试验，筛选出效果最好的杀菌剂，进而为花生冠腐病的有效防治提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试样品：2019—2021年花生生育期间，从安徽省固镇县、泗县、肥东县等不同花生产区采集冠腐病典型病株。

供试培养基：PDA培养基、花生秸秆培养基、大豆培养基、麦粒培养基，培养基的具体制作方法参照张建航等^［10］。

供试药剂：75%百菌清可湿粉剂、50%多菌灵可湿粉剂、70%代森锰锌可湿粉剂、3%甲霜恶霉灵水剂、43%戊唑醇悬浮剂。

1.2 病原菌的分离与纯化

取病株茎基部的病部组织，采用组织分离法，将其切成大小2 mm×2 mm的小组织块，表面消毒后，置于PDA培养基上，30 ℃恒温培养2～3 d，在单菌落边缘挑取菌丝，转接到新的PDA培养基上，转接纯化3～4次。纯化后的病原菌4 ℃保存备用。

1.3 病原菌的鉴定

1.3.1 病原菌的形态鉴定。

取纯化后的病原菌菌丝约6 mm置于PDA平板中央，倒置培养7 d左右，每天肉眼观察菌落形态特征和大小，并待孢子产生后，挑取少量菌丝体制片，在显微镜下观察分生孢子形态。

1.3.2 病原菌的ITS鉴定。

取50～100 mg的菌丝，使用真菌DNA提取试剂盒提取菌丝总DNA，试剂盒从生工生物（上海）股份有限公司购买。引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）对病原菌DNA进行PCR扩增。10 μL反应体系：2× Taq  PCR Master Mix 5 μL，10 μmol/L上、下游引物ITS1和ITS4各0.4 μL，DNA模板1 μL（约100 ng），加入灭菌的ddH 2O 6.7 μL。PCR扩增程序：95 ℃变性5 min；94 ℃变性35 s，55 ℃退火55 s，72 ℃延伸1 min，此过程共36个循环；循环结束后，72 ℃补充延伸10 min。扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳检测后，将PCR产物送至生工生物（上海）股份有限公司测序。在NCBI网站上利用BLAST搜索同源序列，并与已知序列进行序列比对与分析。

1.4 致病性测定

以YH1、1016、9102这3个品种为试验材料，催芽后先孢子悬浮液侵染种子，然后再以麦粒为接种体，对病原菌进行致病性测定。纯化后的菌丝在PDA培养基上30 ℃培养7 d左右，用无菌水洗下病原菌孢子，制成浓度1.0×106个/mL的孢子悬浮液，3个供试花生品种的种子置于孢子悬浮液中30 ℃侵染过夜后，分别种于无菌土中。待花生子叶刚长开时，在花生基部用无菌刀切约4 mm2的小口，将接种过菌丝的麦粒均匀埋在植株茎秆与土层交界处四周，以正常生长不作任何处理的花生植株为对照。观察接种后的发病植株与田间症状是否表现一致，从发病植株的茎基部分离病原菌，与接种菌进行对比。

1.5 生物学性状研究

1.5.1 病原菌在不同培养基中的生长情况。

将菌丝分别转接于PDA、麦粒、大豆和花生秸秆制成的4个培养基上，30 ℃培养3 d，每种培养基设3个重复，每天观察菌丝生长情况，记录菌落的直径大小。

1.5.2 病原菌在不同pH PDA平板中的生长情况。

共设8个不同pH（pH 5～1 梯度为1）的PDA培养基处理，将菌丝分别接种于不同处理的培养基上，每个处理3次重复，30 ℃培养3 d，每天记录菌落的直径。

1.5.3 不同温度处理对菌丝生长的影响。

共设50～64 ℃（每处理差1 ℃）15个处理，将大小一致、直径2 mm的菌丝块分别放入加过100 μL无菌ddH 2O的离心管中，每处理3次重复，共45管，分别恒温水浴15 min后，接种于PDA平板上，30 ℃培养，第2天记录菌落直径。

1.6 5种化学试剂的抑菌作用

药剂配制：75%百菌清可湿粉剂配成浓度1.43 g/L，即75%百菌清可湿粉剂0.1 g用70 mL无菌水溶解；50%多菌灵可湿粉剂0.1 g对无菌水50 mL溶解；70%代森锰锌可湿粉剂0.1 g用80 mL无菌水溶解；3%甲霜恶霉灵水剂1 500倍液，即3%甲霜恶霉灵水剂1 mL对无菌水至1 500 mL；43%戊唑醇悬浮剂3 500倍液，即43%戊唑醇悬浮剂100 μL对无菌水至350 mL。

药剂处理：在无菌操作台上，每种药剂用移液枪分别取200 μL，使用涂抹棒将药剂均匀地涂布在PDA平板上，然后将菌丝转接到中央，以涂抹200 μL灭菌水的培养基为对照，每处理4次重复，30 ℃培养3 d，每天记录菌落的扩展直径。

2 结果与分析

2.1 花生冠腐病田间发病症状

2019—2021年花生生育期间，对安徽省花生产区冠腐病田间发病情况调查表明，该病害主要危害花生植株根颈部（图1A）。出苗前发病时，种仁腐烂，病部长出松软的黑色霉状物；出苗后发病时，病原先侵染幼苗的子叶和胚轴，然后侵染茎基部，被侵染组织四周被黑色的孢子所覆盖。随着病情加重，病斑逐渐扩大，整个根颈区变成黑褐色并溃烂，最后幼苗枯萎死亡（图1B、C）。