红大戟根腐病病原鉴定及其生物学特性

摘要 ［目的］分离、鉴定红大戟根腐病的病原菌及掌握该病原菌的生物学特性。［方法］根据病原菌形态特征，结合ITS-5.8S rDNA、tub2和ACT序列分析，依据柯赫氏法则进行致病性试验。［结果］从接种植株中重新分离出形态一致的病原菌，并将其鉴定为大豆茎点霉（Boeremia exigua）。生物学特性研究表明，病原菌最适生长培养基为PDA培养基，最适生长温度为20 ℃或25 ℃，最适培养的pH为5；最适碳源是乳糖，最适氮源是硝酸钾。［结论］这是B. exigua在中国引起红大戟根腐病的首次报道；掌握其生物学特性，为红大戟根腐病的防治奠定理论基础。

关键词 红大戟；根腐病；大豆茎点霉；鉴定；生物学特性

中图分类号 S 435.672  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2025）02-0178-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.02.035

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Identification and Biological Characteristics of the Root Rot Pathogen of Knoxia roxburghii

LIU Chun-ju ZHANG Lei  LI Heng3 et al

（1.College of Traditional Chinese Medicine， Yunnan University of Chinese Medicine， Kunming，Yunnan 650500;2.College of Plant Protection， Yunnan Agricultural University， Kunming，Yunnan 650201;3 R＆D Center of Yunnan Yuntianhua Co.， Ltd.， Kunming，Yunnan 650228）

Abstract ［Objective］ In order to isolate and identify the pathogen of root rot of Knoxia roxburghii and master the biological characteristics of the pathogen. ［Method］ According to the morphological characteristics of the pathogen， combined with ITS-5.8S rDNA， tub2 and ACT sequence analysis， the pathogenicity test was carried out according to Koch’s Rule. ［Result］ The morphologically consistent pathogen was re-isolated from the inoculated plants and finally identified as Boeremia exigua. The studies of biological characteristics showed that the optimum growth medium of pathogen was PDA， the optimum growth temperature was 20 ℃ or 25 ℃， and the optimum pH was 5. The optimum carbon source was lactose， and the optimum nitrogen source was potassium nitrate. ［Conclusion］ This is the first report of B.exigua causing root rot of K. roxburghii in China. Mastering its biological characteristics will lay a theoretical foundation for the prevention of root rot of K. roxburghii.

Key words Knoxia roxburghii;Root rot;Boeremia exigua;Identification;Biological characteristics

红大戟［Knoxia roxburghii（Sprengel）M.A.Rau］为茜草科（Rubiaceae）红芽大戟属（Knoxia）植物，为多年生草本^［1-2］，其主要化学成分有蒽醌及三萜类，蒽醌类也是抗肿瘤药物的重要来源，可用于治疗癌症，具有泻水逐饮、消肿散结等功效^［3］，因其疗效显著，在临床上得到大量广泛应用，是紫金锭（散）、骨通贴膏等上百种上市中成药的原料^［4-5］。随着红大戟块根需求量的增长，供不应求的市场业绩激发了农民的种植热情，红大戟在野生引种驯化过程中病害问题也频繁发生，以根部病害尤为突出，这严重阻碍了红大戟产业的健康发展。2021年云南省大理白族自治州祥云县红大戟种植示范基地红大戟根腐病发病情况严重，该病田间发病率为15%～30%，对红大戟的产量和品质影响较为严重。目前，红大戟的根腐病病原菌及发病原因尚不清楚。为此，该研究拟采用形态学和分子生物学的方法，对所分离的病原菌进行鉴定，并对其致病性进行验证，开展病原菌的生物学特性研究，为该类病害的防治奠定一定的基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2022年8月，以云南省祥云县红大戟种植示范基地的红大戟根腐样品为研究对象，对其进行病原菌的分离和鉴定。一年生长势良好的红大戟（云戟1号）进行后续的接种试验^［6］。

1.2 菌株分离与纯化

将腐烂的红大戟病根用流动的自来水冲洗干净，用解剖刀将病健交界部位切成0.5 cm×0.5 cm的薄片，75%乙醇和1% NaClO灭菌后用无菌水漂洗3～5次。采用无菌滤纸吸干水分后转移至马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上，在25～28 ℃下进行3 d的培养得到纯化菌株^［7］。

1.3 形态学鉴定

将纯化后的菌株接种于PDA培养基、燕麦琼脂（OA）培养基上，25～28 ℃暗培养10 d后观察菌落形态。载玻片上滴入无菌水后挑取小黑点及菌丝放入，利用显微镜观察孢子及菌丝形态，显微镜拍照后孢子大小用ImageJ软件测量^［7］。

1.4 DNA提取与分子鉴定

简化的CTAB法用于提取病原菌菌丝DNA，用引物ITS1/ITS4^［8］、Bt2a/Bt2b^［9］和ACT-512F/ACT-783R^［10］分别扩增核糖体内源ITS-5.8S rDNA、tub2和ACT区域。组装后的核苷酸序列，经NCBI中的Blastn比对后，利用软件MEGA-X中的邻接法构建近缘菌株的系统发育树^［7］。

1.5 致病性验证

采用菌丝块接种方法进行致病性检测，无菌土种植的一年生红大戟幼苗，将在PDA培养基上培养10 d的病原菌，用无菌手术刀切成5 mm×5 mm，每株根边接种10块，以无菌未接种病原菌菌丝的PDA培养基为对照。每个处理10株，重复3次。置于25 ℃、相对湿度70%条件下培养40 d，统计植株的发病情况。从感病的红大戟根上再次进行病原菌的分离与鉴定，以验证柯赫氏法则。

1.6 病原菌的生物学特性

1.6.1

病原菌最适培养基的筛选。选取实验室常用的5种培养基（PDA、PSA、MEA、CMD、WA）。病原菌在PDA培养基上培养10 d后，打取直径为5 mm的边缘菌饼接种到以上5种培养基上，用封口薄膜密封。每个处理重复3次。在25 ℃黑暗条件下，以十字形交叉法测定各病原菌在不同培养基上的生长情况，直至有处理长满培养皿（90 mm）后停止记录^［11］。

1.6.2 温度对病原菌生长的影响。选取PDA培养基作为基础培养基，5 mm的病原菌接种到PDA培养基中心，封口膜密封后做好标记，放置于15、20、25、30 ℃的恒温培养箱中培养，每个处理重复3次，菌落测量方法同“1.6.1”。

1.6.3 初始pH对病原菌生长的影响。选取PDA培养基作为基础培养基，用0.1 mol/L的盐酸和氢氧化钠溶液配制相应浓度的培养基（pH 4～pH 14），共计11个浓度。平板制好后接入5 mm的病原菌边缘菌饼，置于25 ℃培养箱中暗培养，处理重复和菌落测量方法同“1.6.1”。

1.6.4 不同碳氮源对病原菌生长的影响。选取PDA培养基作为基础培养基，分别用葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖作为碳源，蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、硝酸钾、氯化铵作为氮源，以未加碳源和氮源的培养基作为对照（CK）。选取等摩尔的碳原子和氮原子代替基础培养基中的碳源和氮源，培养皿平板制好后，接种及测量方法同“1.6.1”。

2 结果与分析

2.1 红大戟根腐病田间症状

患病的红大戟根部为褐色至深褐色，叶片伴有枯萎症状，茎基为褐色，根部内部病斑切面呈红棕色（图1）。综合发病特点及症状，将该病称为红大戟根腐病。

2.2 病原菌的形态特征

从典型的根腐病症状的发病红大戟上分离获得与Boeremia spp.菌落形态结构相似的菌株有10株。菌落在PDA培养基上培养初期为灰白色，之后变成淡橄榄绿色，气生菌丝发达，菌丝表面有无色透明小水珠，边缘呈白色的耦节状，背面黑褐色（图2A、B）。在OA培养基培养 30 d 后有分生孢子基质产生（黑色小点）（图2C）。分生孢子椭圆到长圆，单孢无隔膜，大小（2.6～6.9）μm×（1.5～3.1）μm（图2D）；无厚垣孢子^［12］。

2.3 病原菌的分子生物学鉴定

随机挑选3株病原菌，单孢分离纯化后，提取菌丝DNA后用ITS、tub2和ACT 3对引物进行扩增测序。结果显示，组装后的3株病原菌的核苷酸序列是一致的。选择一株具有代表性的序列上传至NCBI。ITS序列（OR142417）与Boeremia exigua（MT154624）相似性为100%（518/533 bp）；tub2序列（OR146750）与B.exigua（OP611567）相似性为100%（316/335 bp）；ACT序列（OR146751）与B.exigua（OP611566）相似性为100%（231/247 bp）。以ITS、tub2和ACT 3对引物序列构建系统发育树结果显示（图3），该菌株与B.exigua聚在同一分支上，其分支的自举值为99%。根据该菌的形态学和分子生物学鉴定结果，将该病原菌鉴定为大豆茎点霉（B.exigua）^［13］，命名为ByF12。