60份广西茶树种质资源的染色体倍性鉴定

摘要 基于流式细胞仪对植物染色体倍性鉴定的高效性和准确性，利用流式细胞仪分2批次对60份广西茶树种质资源的染色体倍性进行鉴定分析，以期得到种质资源准确的染色体倍性信息，为茶树育种提供科学依据。共鉴定出茶树二倍体53份，三倍体6份，单倍体1份，未检测到四倍体。而检测到的单倍体茶树180（龙脊古树2号）在后续的茶树染色体加倍获得多倍体育种提供原始材料，为茶树的多倍体育种和运用研究提供参考。

关键词 茶树；种质资源；染色体倍性；流式细胞术；鉴定

中图分类号 S 571.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2025）05-0010-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.05.003

Chromosome Ploidy Identification of 60 Germplasm Resources of Tea Plants in Guangxi

HUANG Shou-hui， PENG Jing-ru， WEN Li-xiang et al

（Gungaxi Subtropical Crops Research Institute， Nanning，Guangxi 530001）

Abstract Given the efficiency of flow cytometry in determining plant ploidy，in this study，flow cytometry was employed to identify the ploidy of 60 tea tree germplasm resources in Guangxi，aiming to obtain accurate ploidy data to support tea plant breeding. The result showed that a total of 53 diploids，6 triploids，and 1 haploid were identified，but no tetraploid was detected. The identified haploid tea tree 180（Longji Ancient Tea Tree No.2）will serve as the original material for subsequent tea plant chromosome doubling to produce polyploid breeding materials，thus providing a reference for the breeding and utilization of polyploid tea trees.

Key words Tea plant;Germplasm resource;Chromosome ploidy;Flow cytometry;Identification

茶树［Camellia sinensis （L.）O. Ktze.］是山茶科［Theaceae Mirb.（1816）］山茶属（Camellia L.）灌木，是我国重要的经济作物，其叶片可制成茶，种子可用于榨油，其木因材质紧实可用于雕刻。广西地跨西南、华南茶区，是茶树的次生起源中心，茶树种质资源丰富，遗传多样性大［1-3］。

茶树是山茶属相对原始的物种，染色体数目复杂，倍性多样。细胞学研究表明，常见茶树天然群体为二倍体植株（2x-30），但在自然群体中，不断发现不同染色体数目的茶树品种，三倍体（二倍体-3x-45）、四倍体（二倍体-4x-60）和非整倍体（二倍体+2）等均有［4］。由于遗传基础复杂，这给茶树多倍体开发利用带来了难度［5］。

在茶树染色体倍性研究和利用方面，前人开展了大量工作。20世纪60年代有利用花药培养诱导单倍体研究，却鲜见有关茶树单倍体植株的报道。报道较早的是1988年陈振光等［6］以“福云7号”花药为材料诱导出了茶树单倍体植株。屈文琦等［7］在分析我国32个具有代表性的无性系茶树品种染色体倍性时发现，茶树无性系品种以二倍体为主（约占81%），同时也发现三倍体是常见的多倍体染色体型。王守生等［8］在对四川野生大茶树群体研究时发现了1株天然四倍体茶树并编号为“9006”，在对其生物学特性进行研究时，发现其抗寒耐旱性弱，环境适应性也较差。李素芳［9］于1996年鉴定分析了云南勐海、浙江、广西桂林等地的100份茶树种质资源染色体倍性，结果显示，98份是二倍体，只有2份存在染色体数目变异。李斌等［10］分析广东、广西茶区的10个茶树品种染色体倍性时发现，广东平远锅笃茶品种中部分为三倍体。王春梅等［11］借助染色体核型分析技术研究了6种不同类型崇州枇杷茶树的进化和变异程度，为该品种的起源进化提供了研究依据。李瑞林［12］基于FISH技术建立了茶树倍性检测体系，鉴定到“舒茶早”“白毫早”“福云6号”为二倍体，“政和大白茶”“杭州大叶”为三倍体，“上浮洲”愈伤组织为四倍体。众多研究表明，抗逆性强，适应性广，内含物丰富，光合效率高，营养生长旺盛，可育性低，发芽早，发芽率高等是茶树多倍体的突出特点，这些特点是茶树新品种培育的重要基础资源［13］。

由于多倍体茶树通常会表现出较强的生命力和优良的农艺性状。因此，研究分析茶树倍性，可以更好地了解茶树遗传背景特征，为进行茶树的杂交育种和基因分析提供原材料信息。目前，流式细胞仪已被广泛用于动植物的 DNA 含量检测、倍性鉴定等研究中，其原理和步骤为：用染色剂对细胞染色体进行染色，随后上机检测，依据荧光密度与DNA 含量成正比的关系，以获取的峰值图直观地反映不同染色体倍性细胞所占的比例。笔者利用流式细胞仪，从分子水平上对种植于广西壮族自治区亚热带作物研究所茶树种质资源圃的60份茶树种质资源进行染色体倍性鉴定和分析，以期为广西茶树的多倍体育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 茶树种质资源

所有茶树种质资源均来自广西各产茶区保存于广西壮族自治区亚热带作物研究所茶树种质资源圃。取样时间为8：00—9：00，取样部位为刚展开的嫩叶。将采集的新鲜叶片，用打湿的滤纸包裹之后放入自封袋中并做好标记，然后放入4 ℃泡沫箱密封保存待用。该试验共分2个批次采集，第1批采集20份样本（表1），第2批采集40份样本（表2），共采集样本60份。2个批次测试的对照样本均为二倍体金牡丹。

1.2 试验方法

1.2.1 试验仪器与试剂。

使用的倍性检测仪器是CyFlow Space Flow Cytometer （Sysmex Partec， Muenster， Germany）；检测试剂盒为Partec CyStain UV Precise P （Sysmex Corporation，USA）。

1.2.2 试验步骤。

取采集的新鲜茶树叶片0.5 cm2，放于培养皿中央。取Partec CyStain UV Precise P核裂解液400 μL滴于茶树叶片周围，快速用锋利刀片切成0.5 mm左右碎片（不可切得太碎或直接研磨，避免细胞核悬液杂质过多和过于黏稠），从而提取出完整的细胞核，提取时间60 s。接着用30 μm滤网将培养皿中的液体过滤至样品管中，随后向样品管中加入Partec CyStain UV Precise P染色液1 600 μL，染色30 s。接着进行上机测试：调整Gain值和Threshold阈值，使标样（对照样本）的荧光强度在100 （横坐标）或50，根据标样（对照样本）的具体倍性确定。检测速度为0.5～2.0 μL/s。确定标样（对照样本）后，取出待测样品，重复上述步骤。上机测试后，观察测试样品荧光强度的位置，与标样（对照样本）进行比较。

1.2.3 结果判定方法。

样本峰值的荧光强度X-Mean （横坐标）与单个细胞DNA含量成正比，因此由各样本X-Mean之间的比例关系可以初步判断倍性。如，将对照的二倍体峰调整在横坐标200位置，则单倍体会出现在100，峰值在400位置为四倍体。图形的纵坐标代表细胞数量，峰的高低反映细胞比例的不同。随后利用公式：倍性=待测样本的峰值/参照物的峰值×参照物的倍性，根据四舍五入法确定待测样品的倍性。样本之间的误差范围在±5%以内。

为防止仪器热量散发或其他原因造成的数据不准确，每做一批样本试验（8个样本）都要用对照样本进行重新调试，以减少偏峰现象的出现，减少误差，保证所测数据的准确性。

2 结果与分析

2.1 对照样本染色体的倍性测定

在2个批次测试试验中，均以已知二倍体品种 “金牡丹”作为对照样本。在第1批次中，检测调试电压时把“金牡丹”的峰值调到100道的位置（图1A），结果显示“金牡丹”的荧光峰值为106.36；在第2批次中，检测调试电压时把 “金牡丹”的峰值调到200道的位置（图1B），结果显示 “金牡丹”的荧光峰值为190.80。细胞染色体的倍性与细胞核DNA含量成正比的关系，而细胞核的DNA含量又与荧光强度成正比，因此根据其荧光值与对照样本的荧光峰值比对结果可以推测出待测样品染色体的倍性。如果测试样本的 G0/1 峰的峰值位置与已知二倍体“金牡丹”（图1）的位置基本相仿，位置的偏移可能是由于不同品种基因组大小的差异造成，可以判断其为二倍体。同样，可以根据G0/1 峰比值初步判断测试样本是否为三倍体、四倍体。需要注意的是在测每一批样品前都要用对照组进行重新调试，从而减少偏峰现象的出现，减小误差。

2.2 茶树测试样品染色体的倍性分析

通过对未知样品的检测，将获得的峰值与对照样品的峰值进行比对，即可鉴定出待测样品染色体倍性。在第1批样本中，分别以田间编号4号（德保古树1号）和21号（安塘种） 2个茶树种质资源为代表进行分析说明（图2），其他茶树种质资源的分析同理。与对照样本（金牡丹）峰值（106.36）的比较可知，4号（德保古树1号）和21号（安塘种）的峰值分别为109.24 （图2A）和153.14 （图2B），由此可知，4号（德保古树1号）峰值与已知二倍体“金牡丹”相近，可以判断其为二倍体。21号（安塘种）峰值与已知二倍体“金牡丹”峰值比值为 1.44，可以初步判断出21号（安塘种）样本为三倍体。在第2批样本中，分别以田间编号150 （丰相平1号）和180（龙脊古树2号）2个茶树种质资源为代表进行分析说明（图3），其他茶树种质资源的分析同理。根据与对照样本“金牡丹”峰值（197.40）和云抗10号峰值（208.27）的比较，田间编号150 （丰相平1号）和180（龙脊古树2号）的峰值分别为223.77 （图3A）和97.36 （图3B），由此可知，田间编号150 （丰相平1号）峰值与已知二倍体 “金牡丹”相近，可以判断其为二倍体。田间编号180（龙脊古树2号）峰值与已知二倍体 “金牡丹”峰值比值为 0.49，可以初步判断出田间编号180（龙脊古树2号）样本为单倍体。

以此作为判断依据，共检测60份不同茶树种质资源染色体倍性，通过数据分析（表3、表4）可知，除了表3中1号（罗香1号）、3号（凌云白毫）、5号（宁明古树1号）、20号（灵山茶园群体种）、21号（安塘种）和23号（姑辽古树茶）6份种质资源为三倍体，表4中180号（龙脊古树2号）为单倍体种质资源外，其余53份均为二倍体种质资源。在这60份种质资源中，未发现有四倍体茶树种，三倍体所占比例也较少，大部分以二倍体茶树为主（占88.3%）。虽然这60份样本中未检测到四倍体及以上的样本，但检测到1个单倍体种质180号（龙脊古树2号），在后续育种工作中，可以利用180号（龙脊古树2号）为研究材料，经过染色体加倍处理，即可在较短时间内获得茶树纯系，从而创制新的育种材料，这对于开展茶树遗传和茶树育种研究均具有重要意义。