一株乌拉尔甘草内生真菌的分离鉴定及其抑菌活性评价

摘要 采用组织块分离法，从野生乌拉尔甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）的根部分离得到一株内生真菌GG5-1，经分子生物学鉴定为Neocosmospora rubicola。通过生长速率法对油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）和葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea）进行抑菌活性评价，结果表明，乌拉尔甘草内生真菌GG5-1大米发酵提取物在0.1 mg/mL对油菜菌核病菌有强烈的抑制效果，抑制率为（97.28±0.77）%。

关键词 乌拉尔甘草；内生真菌；分离鉴定；抑菌活性

中图分类号 Q 93 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2025）05-0149-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.05.031

Isolation， Identification and Antibacterial Activity Evaluation of an Endophytic Fungus from Glycyrrhiza uralensis Fisch.

XIONG Cai-zhi1， CAO Jin-feng1， ZHAO Jiang-yuan2 et al

（1.Ningxia Normal University， Guyuan， Ningxia 756000; 2.Yunnan Institute of Microbiology， Yunnan University， Kunming， Yunnan 650091）

Abstract An endophytic fungal strain GG5-1 was isolated from the roots of Glycyrrhiza uralensis by the method of tissue-block isolation and identified by molecular biology as Neocosmospora rubicola. Bacteriostatic experiments on Sclerotinia sclerotiorum and Botrytis cinerea were conducted by the growth rate method，the results showed that rice fermentation extract of endophytic fungus GG5-1 from G. uralensis had a strong inhibitory effect against Sclerotinia sclerotiorum at 0.1 mg/mL， with an inhibition rate of （97.28±0.77）%.

Key words Glycyrrhiza uralensis Fisch.;Endophytic fungal;Isolation and identification;Antimicrobial activity

乌拉尔甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）为豆科（Leguminosae）蝶形花亚科（Papiliantae）甘草属（Glycyrrhiza）多年生草本植物，被誉为“宁夏五宝”之一，是一种历史悠久的珍贵药材，主要分布于我国的东北、华北、西北各省（区），常生于干旱沙地、河岸砂质地、山坡草地及盐渍化土壤中［1］。目前国内外对其研究主要在植物化学方面，主要成分为黄酮和三萜皂苷类化合物［2-4］，具有抗溃疡、抗炎、解痉、抗氧化、抗病毒、抗癌、抗抑郁、保肝、祛痰、增强记忆力等生物活性［5-7］。

植物内生真菌代表了一个复杂的微生物群落，与病原菌会使植物染病不同，它们在植物的内部健康组织中定殖，与植物形成了一种互利共生的重要关系［8-9］。作为一种特殊生境的微生物，在长期的进化过程中，内生真菌可能会有着与宿主相关或特有的代谢途径。在地球上的任何角落，只要有植物生活就有植物内生真菌在植物内定殖，这就决定了内生真菌具有强大的生物合成能力，是一个极具潜力且庞大的微生物资源宝库。另外，与植物资源不同，内生真菌有着易于培养、生长速度快、可调控发酵条件等优点，是一类可持续发展的生物资源。近年来学者们对乌拉尔甘草这一道地药材的研究逐渐从植物本体转向于其内生真菌的研究，而对乌拉尔甘草内生真菌的研究则主要集中于抑菌、抗氧化、抑制α-葡萄糖苷酶活性等方面。刘文杰等［10］从乌拉尔甘草中分离鉴定了135株内生真菌，其中35株内生真菌的代谢粗提物对金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌有广谱的抑菌活性；杨明俊等［11］分离鉴定了36株乌拉尔甘草内生真菌，部分菌丝体乙醇回流提取物、发酵液的乙酸乙酯相和正丁醇相具有抑菌、抗氧化、抑制α-葡萄糖苷酶等活性。尽管乌拉尔甘草内生真菌以及其活性已有许多相关研究，但是对于乌拉尔甘草内生真菌抗植物病原真菌活性的研究鲜见报道。该研究从乌拉尔甘草的根部分离鉴定了一株内生真菌GG5-1，并初步研究其对2株重要植物病原真菌的抑菌活性，为后续进一步开发乌拉尔甘草内生真菌生物防治潜力、研究其次生代谢产物活性提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试材料。宁夏乌拉尔甘草采自宁夏中卫市。

1.1.2 供试植物病原真菌。葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum），由云南大学云南省微生物研究所提供。

1.1.3 培养基。马铃薯葡萄糖固体培养基（PDA）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，氯化钠 50 g，水1 000 mL；大米固体培养基：大米50 g，水50 mL。以上培养基使用前均经过高压灭菌锅121 ℃、20 min灭菌。

1.2 试验方法

1.2.1 乌拉尔甘草内生真菌的分离和纯化。将采集到的新鲜宁夏乌拉尔甘草根部表面清洗干净，用自来水冲洗 2 h，用滤纸吸干水分，备用。在超净工作台中，将备用的植物组织按文献［12］改良的步骤操作：①用 75%乙醇浸泡1 min，无菌水冲洗4次；②用4% 次氯酸钠浸泡 5 min，无菌水冲洗4次；③用75%乙醇漂洗30 s，无菌水冲洗4次；④以无菌滤纸片吸干水分。将上述表面消毒的组织用灭菌的手术刀分别切成 5 mm×5 mm×1 mm 的小块，接种于配好的PDA 双抗培养基上（含50 mg/L氨苄青霉素和50 mg/L硫酸链霉素），每个培养皿中接种 4 块，28 ℃恒温培养。待植物组织切口长出菌丝后用灭菌的竹签挑取菌落尖端的菌丝，采用平板划线法在PDA培养基上进行纯化，纯化后的菌种在-80 ℃下保存于25%甘油管中。

在处理、接种组织块时，将一个PDA平板敞开放在超净工作台中，以检验操作环境是否无菌。另外，取最后一次冲洗的无菌水200 μL均匀涂布在PDA平板上，并采用组织印迹法来验证植物组织表面消毒是否彻底。若上述培养皿未长出菌落，证明植株的表面消毒和环境的无菌是可靠的。

1.2.2 内生真菌的分子生物学鉴定。将乌拉尔甘草内生真菌GG5-1在PDA培养基上于28 ℃培养至快长满平板，再用竹签挑取菌丝体，按照真菌 DNA 提取试剂盒的方法进行提取DNA。真菌的ITS基因序列PCR扩增使用的通用引物ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）由擎科生物昆明分公司合成提供。其中PCR扩增体系与程序按文献中的方法［13］进行，总体系为50 μL：Genomic DNA 1 μL，10×KOD buffer（含Mg2+）5 μL，dNTPs（2 mmol/L）5 μL，KOD DNA Polymerase（5 U/μL）1 μL，ITS4（10 μmol/L）1 μL，ITS5（10 μmol/L）1 μL，ddH2O 36 μL。扩增程序：94 ℃ 3 min，1个循环；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，35个循环；72 ℃ 10 min，1个循环。PCR产物由擎科生物昆明分公司进行纯化与测序。将所得ITS序列在美国国立生物技术信息中心NCBI（National Center for Biotechnology Information）GenBank中进行BLAST比对，用MEGA 7.0.26软件中ClustalW功能进行多序列比对，裁剪两端未对齐序列，再用邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建系统发育树。

1.2.3 内生真菌GG5-1的发酵培养与提取。将活化好的内生真菌用6 mm打孔器打成菌饼，再接种于大米培养基（每瓶3块菌饼），用恒温培养箱28 ℃培养28 d。待发酵完成后，用甲醇超声辅助提取3次，每次30 min得到甲醇提取物，再用水悬浮乙酸乙酯萃取3次得到内生真菌GG5-1大米固体发酵提取物，并用甲醇配成10 mg/mL备用。

1.2.4

内生真菌GG5-1发酵提取物的抗植物病原真菌试验。在超净工作台中，将0.2 mL的内生真菌GG5-1发酵提取物加至已灭菌并冷却至约50 ℃的20 mL马铃薯葡萄糖固体培养基中，然后迅速摇匀制成终浓度为0.1 mg/mL的含药培养基，再倒入平板冷却得到含药抗真菌活性测试平板。将活化好的植物病原真菌用6 mm的无菌打孔器制成直径6 mm的菌饼，菌丝面朝下接种于含药培养基上，倒扣于恒温培养箱中28 ℃培养。空白对照组则使用不含药的马铃薯葡萄糖固体培养基进行培养，试验组和空白对照组均进行3次平行试验。待空白对照组的植物病原真菌菌落长至平板的1/2时，用十字交叉法［14］测量菌落直径，并按以下公式计算植物病原真菌生长抑菌率：

抑菌率=（对照组菌落直径-试验组菌落直径）/（对照组菌落直径-菌饼直径）×100%

2 结果与分析

2.1 乌拉尔甘草内生真菌GG5-1的分离鉴定

从一株健康的乌拉尔甘草的根部成功分离得到一株内生真菌GG5-1（图1）。将内生真菌GG5-1测得的ITS序列在美国国立生物技术信息中心NCBI GenBank中BLAST比对后，下载相似度高的相关菌种ITS基因序列。使用MEGA 7.0.26软件中的ClustalW功能进行排序，将多序列比对后的序列裁剪掉两端未对齐的序列，再用邻接法（NJ）构建系统发育树，参数设置为Bootstrap method检验取样进行1 000次，矩阵距离使用Kimura 2-parameter model进行计算，Gaps/Missing Data Treatment采用Complete deletion模型，构建的系统发育树如图2所示。从邻接法构建的系统发育树（图2）可以看出，内生真菌GG5-1与Neocosmospora rubicola CBS 101018（Accession No.NR_154227.1）聚为一簇，置信度为96%。通过BLAST比对分析与Neocosmospora rubicola CBS 101018的相似度为100%。最终通过分子生物学的鉴定，认为内生真菌GG5-1为子囊菌门（Ascomycota）盘菌亚门（Pezizomycotina）粪壳菌纲（Sordariomycetes）肉座菌亚纲（Hypocreomycetidae）肉座菌目（Hypocreales）丛赤壳科（Nectriaceae）镰刀菌属（Fusarium）的Neocosmospora rubicola。

2.2 乌拉尔甘草内生真菌GG5-1发酵提取物的抑菌试验

用葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea）和油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）这2种重要的植物病原真菌作为目的病原菌，以菌丝生长速率法检测了乌拉尔甘草内生真菌GG5-1大米发酵提取物的抑菌活性。如图3所示，乌拉尔甘草内生真菌GG5-1大米发酵提取物对油菜菌核病菌的抑制效果最强，抑制率为（97.28±0.77）%，对葡萄灰霉病菌的抑制效果较弱，抑制率为（28.82±0.94）%。抑菌试验结果表明，乌拉尔甘草GG5-1大米发酵提取物对这2种重要植物病原真菌均有一定的拮抗作用，其中对油菜菌核病菌有强烈的抑制效果，而对葡萄灰霉病菌有弱的抑制效果。