应用大蒜素缓解牛子宫内膜炎损伤的研究

摘要 ［目的］研究大蒜素对牛子宫内膜炎损伤的治疗作用。［方法］采用脂多糖诱导牛子宫内膜上皮细胞建立炎性细胞模型，探讨大蒜素的抗炎机制。筛选最佳LPS浓度；通过ELISA方法、荧光定量PCR技术和Western blot方法分别检测细胞炎症因子的含量、mRNA相对表达量和蛋白相对表达量。［结果］不同浓度的LPS均能够提高细胞的增殖量，当LPS浓度为30 μg/mL时细胞活力最高。与炎性细胞相比，大蒜素可抑制LPS诱导的子宫内膜上皮细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8炎性因子的分泌，也能降低IL-1β、TLR4和NF-κβ p65的基因转录水平。Western blot分析结果表明，大蒜素能够抑制TLR4和NF-κβ p65蛋白的表达。［结论］大蒜素能够抑制TLR4/NF-κβ信号通路，通过调节细胞炎症因子的分泌发挥抗炎活性。

关键词 牛子宫内膜上皮细胞；大蒜素；炎性反应；细胞因子

中图分类号 S858.23 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2025）06-0085-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.06.020

Study on Alleviating Bovine Endometritis Injury with Allicin

CHU Qiu-xia， CHEN Fu-ying， FENG Ya-jie et al

（Institute of Animal Husbandry， Henan Academy of Agricultural Sciences/Henan Provincial Key Laboratory of Livestock and Poultry Breeding and Nutrition Regulation， Zhengzhou，Henan 450002）

Abstract ［Objective］ To study the treatment  effect of allicin on bovine endometritis injury. ［Method］ Bovine endometrial epithelial cells were induced by lipopolysaccharide to establish an inflammatory cell model， and explore the anti-inflammatory mechanism of allicin.The optimal concentration of LPS was screened out. The secretion， mRNA relative expression and protein relative expression of inflammatory factors were detected by ELISA， fluorescence quantitative PCR and Western blot method. ［Result］ Different concentrations of LPS could improve cell proliferation， and the cell viability was the  highest when LPS concentration was 30 μg/mL. Compared with inflammatory cells， allicin could inhibit the  secretion of inflammatory factors TNF-α， IL-1β， IL-6 and IL-8 in LPS-induced endometrial epithelial cells， and also reduced the gene transcription levels of IL-1β， TLR4， and NF-κβ p65.Allicin inhibited the expression of TLR4 and NF-κβ p65 proteins by Western blot analysis. ［Conclusion］Allicin can inhibit the TLR4/NF-κβ signaling pathway and exert anti-inflammatory activity by regulating the secretion of inflammatory cytokines in cells.

Key words Bovine endometrial epithelial cells；Allicin；Inflammation；Cytokines

牛子宫内膜上皮细胞是病原菌进入子宫的第一道防线，一旦被病原微生物感染会引起子宫内膜炎的发生，导致母牛屡配不孕、体重降低，严重影响母牛的繁殖能力，是临床上急需解决的问题之一。生活中一些药食同源的原料具有显著的抗炎效果，能够避免因服用合成抗炎药而造成的毒副作用［1］，是未来疾病治疗的重要药物来源。

大蒜素具有安全性高、无残留、抗炎、不产生耐药性等优点，对反刍动物具有促生长、增强机体抵抗力、改善机体抗氧化性及抑菌性等功效［2-3］。大蒜素能够抑制致病菌，如大肠杆菌、伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌、变形杆菌和链球菌等，大蒜素作为一种活性抗炎成分已被广泛应用［4-6］。然而，大蒜素对牛子宫内膜炎是否具有抑制作用尚未见报道。笔者探讨了大蒜素对牛子宫内膜炎的体外抗炎作用，以期为大蒜素治疗牛子宫内膜炎的临床用药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

大蒜素、LPS、CCK8、PBS（北京索莱宝公司）、ELISA试剂盒（上海朗顿生物公司）、RNA提取试剂（赛默飞公司）、引物（生工生物工程（上海）股份有限公司）、TLR4 抗体、β-actin抗体（美国CST公司）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠/兔抗体（河南天驰生物技术有限公司）、DMEM/F12培养基和胎牛血清（美国Gibco公司）。

1.2 细胞培养

将实验室冻存的牛子宫内膜细胞进行复苏后，接种于含10%FBS+双抗的DMEM/F12培养液中，置于37.5 ℃、5%CO2饱和湿度的无菌培养箱中。每2～3 d更换培养液1次，取对数生长期的牛子宫内膜细胞用于试验。

1.3 药物浓度筛选和分组

待细胞生长汇合至80%，0.25%胰酶消化细胞，制成密度5×104个/mL的细胞悬液，接种于96孔板上。LPS浓度梯度为0、1、20、30、50和100 μg/mL，处理细胞24 h。

试验分为对照组（正常细胞）、炎性模型组（LPS组，用1 μg/mL的LPS处理细胞24 h）、LPS+大蒜素组（1 μg/mL的LPS处理细胞24 h后，加入5 μg/mL大蒜素继续培养处理24 h）。

1.4 ELISA方法检测TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的含量

药物处理后，分别收集各孔细胞上清液，3 000 r/min离心后取上清，按照ELISE试剂盒说明书检测细胞上清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的含量。

1.5 实时定量PCR检测IL-1β、TLR4、NF-κβ p65基因的转录

收集细胞，用PBS缓冲液冲洗2遍，提取细胞总RNA，测定总RNA的浓度；取600 ng的总RNA，按照反转录试剂盒操作说明书将mRNA反转录，获得的cDNA用于定量PCR，检测IL-1β、TLR4、NF-κβ p65的基因转录水平。具体引物序列信息见表1。

1.6 Western blot方法检测细胞炎症因子的表达

取出最佳条件下处理的细胞，收集细胞提取蛋白。按照试剂说明书进行操作，检测TLR4、NF-κβ p65蛋白表达水平。试验重复3次，取平均值。

1.7 数据统计与分析

利用SPSS 11.5统计软件对试验数据进行统计与分析。

2 结果与分析

2.1 牛子宫内膜细胞形态观察和活力检测

牛子宫内膜细胞未贴壁时生长速度快，细胞呈椭圆形。传代后3 h左右贴壁，大多数呈圆形或椭圆形生长。10 μg/mL LPS诱导72 h，细胞多呈四角形或多边形，细胞质出现颗粒性物质，伸出伪足，与CK（图1A）相比细胞活力有所提高，如图1B所示。100 μg/mL LPS诱导72 h，细胞质颗粒性物质增多，细胞活力有所下降（图1C）。

通过细胞活力试验预估大蒜素对牛子宫内膜细胞活性的影响，结果如图2所示。从图2可以看出，与CK相比，不同浓度的LPS对牛子宫内膜细胞都有增殖作用，随着LPS浓度的增加，细胞增殖速度有所下降。1 μg/mL LPS能够诱导牛子宫内膜细胞产生炎症反应，其对细胞活力无明显影响。因此，试验选用1 μg/mL的LPS诱导子宫内膜细胞进行后续试验。

2.2 大蒜素对炎症细胞因子分泌的影响

利用1 μg/mL LPS和不同浓度大蒜素诱导牛子宫内膜细胞进行炎症因子分泌试验，结果如图3所示。从图3可以看出，与对照组相比，LPS组TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的含量均有所升高。与LPS组相比，各大蒜素组TNF-α、IL-1β和IL-6和IL-8的含量均有所降低。

2.3 大蒜素对炎症相关基因转录水平的影响

如图4所示，与对照组相比，LPS组NF-κβ p65、TLR4和IL-1β mRNA表达量均有所升高；与LPS组相比，大蒜素+LPS组NF-κβ p65、TLR4和IL-1β mRNA表达量均有所降低。

2.4 大蒜素对炎症关键蛋白表达量的影响

如图5所示，与对照组相比，LPS组TLR4、NF-κβ p65的蛋白表达量都有不同程度的升高；大蒜素+LPS组TLR4和NF-κβ p65的蛋白表达量较LPS组明显降低。以上结果表明添加大蒜素能够降低TLR4、NF-κβ p65的蛋白表达水平。

3 讨论

子宫内膜炎通常发生在母牛繁育场和奶牛场，能严重影响养殖户的经济收益。细菌是导致子宫内膜炎的主要病原［7］。脂多糖是细胞壁的主要成分，是导致细胞产生炎症反应的重要物质，已被广泛应用于炎症模型的研究［8］。该研究采用不同浓度LPS进行活力测定，结果发现不同浓度的LPS对牛子宫内膜细胞具有增殖的效果。随着LPS浓度的增加，细胞活力不断提高，当LPS浓度为30 μg/mL时细胞活力最强。该试验采用1 μg/mL LPS处理牛子宫内膜细胞24 h后，经ELISA检测发现LPS组TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的含量均高于对照组，后续试验采用1 μg/mL LPS作为体外炎症细胞模型。

细胞因子分为促炎因子和抗炎因子，通过动态平衡细胞因子能够调控免疫作用，维持着机体健康。在LPS的作用下，机体细胞与Toll样受体（TLR）结合，巨噬细胞被激活，核因子-κβ（NF-κβ）被活化，促炎介质和细胞因子大量产生，导致炎症的发生。例如，白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）、白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）在LPS诱导的巨噬细胞中过表达，会导致各种炎症性疾病的发生［9］。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和IL-8能够影响牛子宫内膜和卵巢激素的分泌，从而影响动物机体的生殖能力［10］。Zerbe等［11］报道IL-8可以显著促进牛子宫内中性粒细胞的增多。炎性细胞因子应对细菌入侵时，患病牛子宫内IL-6和IL-8的分泌量显著升高，IL-6 mRNA表达量也显著升高［12］。该研究利用LPS刺激牛子宫内膜上皮细胞，经大蒜素处理后TNF-α、IL-1β和IL-6和IL-8的分泌量均低于LPS组。推测大蒜素可能抑制 NF-κB 信号通路，减少炎症细胞因子的产生，该研究结果与Zhao等［13］研究结果相一致。