番茄bHLH转录因子SlbHLH077的克隆及表达分析

摘要 bHLH转录因子作为真核生物中最大的基因家族之一，在植物生长发育以及非生物胁迫中扮演着关键的角色。为更进一步研究bHLH转录因子在番茄中的功能及表达特征，以番茄幼苗为试验材料，在番茄中克隆得到CDS全长为1 739 bp的SlbHLH077基因，通过生物信息学手段对该基因进行基本特征分析，同时结合实时荧光定量技术研究了该基因在生物胁迫与非生物胁迫下的表达模式。结果表明：该基因只含有1个外显子，不含内含子，编码579个氨基酸，含有典型的HLH保守结构域。编码蛋白的相对分子量为64 271.00 Da，理论等电点为7.59，属于不稳定的碱性蛋白。蛋白互作表明，该蛋白与10个JAZ蛋白相互作用而发挥调解作用。系统发育表明，SlbHLH077与马铃薯的亲缘关系最近，与杜鹃的亲缘关系最远。组织分析表明，该基因在多个组织中均有表达，荧光定量PCR表明该基因响应低温、盐和干旱等非生物胁迫以及激素与黄叶卷曲病等生物胁迫。该研究结果为番茄抗逆育种及进一步探究SlbHLH077的功能提供了理论依据。

关键词 番茄；SlbHLH077；克隆；生物信息学分析；表达特征

中图分类号 S641.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2025）06-0089-09

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.06.021

Cloning and Expression Analysis of Tomato bHLH Transcription Factor SlbHLH077

WANG Wen-ting， WANG Yi-ru， ZHU Wei et al

（Wuhan Vocational College of Software and Engineering （Wuhan Open University）， Wuhan， Hubei 430205）

Abstract As one of the largest gene families in eukaryotes， bHLH transcription factors play a key role in plant growth and development and abiotic stress. In order to further study the function and expression characteristics of the bHLH transcription factor in tomato， this study used tomato seedlings as the test material， cloned the SlbHLH077 gene with a CDS full length of 1 739 bp in tomato， and the basic characteristics of this gene were analyzed by bioinformatics methods.Combined with real-time fluorescence quantitative technology to study the gene expression pattern under biotic and abiotic stress. The results show that the gene contains only one exon， no introns， and encodes 579 amino acids， containing a typical HLH conserved domain. The relative molecular weight of the encoded protein is 64 271.00 Da， and the theoretical isoelectric point is 7.59， which is an unstable basic protein. Protein interaction indicates that the protein interacts with 10 JAZ proteins to play a mediating role. The phylogeny indicated that SlbHLH077 has the closest relationship with potato and the farthest relationship with rhododendron. Tissue analysis showed that the gene was expressed in multiple tissues， and fluorescence quantitative PCR showed that the gene responded to abiotic stresses such as low temperature， salt and drought， and biological stresses such as hormones and yellow leaf curl disease. The results of this study provide a theoretical basis for tomato resistance breeding and further exploration of the function of SlbHLH077.

Key words Tomato;SlbHLH077;Cloning;Bioinformatics analysis;Expression characteristics

植物在其生命周期中不可避免地会受到环境因素的影响（包括生物和非生物胁迫），干旱和盐碱胁迫的增加通常会通过干扰离子稳态，减少养分吸收并加剧氧化胁迫来限制植物的生长和发育［1］。为了适应这些不利的环境胁迫条件，植物在进化过程中形成了多种复杂的应对机制。当植物应对不同胁迫时，信号转导和转录调控在复杂的生物化学和分子调控网络中起着重要作用。迄今为止，已经报道了一系列抗逆性转录因子，它们可以抵抗不同植物中的非生物胁迫耐受性［1-2］。

基本的螺旋-环-螺旋（bHLH）是转录因子的基因家族，具有多种功能，广泛存在于真核生物中。bHLH转录因子因其自身的结构特征而命名［3］，主要由保守的60个氨基酸残基组成，可调节动植物中的许多细胞过程，并且还参与对生物和非生物胁迫的响应［4-5］。根据功能的不同，它们可以分为2部分：基本碱性区域和HLH区域［6］。基本碱性区域分布在bHLH保守结构域的N末端，并包含15～20个与DNA结合有关的残基［6-7］，其中至少5个是具有高度保守的HER基序（His-5，Gly-9和Arg-13）的碱性氨基酸。因此，可以通过基本区域识别被称为E-box的共有六核苷酸（CANNTG）。HLH结构域分布在基因序列的C端，由2个亲水性α螺旋组成，主要由疏水残基组成，这些残基由可变序列和长度的环区连接，这些基序使bHLHs通过蛋白-蛋白相互作用表现出多种类型，并调节其特定功能。HLH结构域是bHLH转录因子中同源或异源二聚体形成的必不可少的结构［8］。在动物中，bHLHs参与许多生理和发育过程，如对环境信号、神经发生、肌发生、性别分化和细胞分化的反应［9-10］。在植物中，bHLHs在许多发育和生物学过程中都起着重要作用，如bHLH在种子萌发的调控中起关键作用［11］；花青素的生物合成，类黄酮合成［12］；激素信号传导［13］；对受伤、干旱、盐分和低温的反应［4］；铁缺乏和磷酸盐饥饿［14］。越来越多的证据表明，bHLH转录因子对于植物对非生物胁迫的反应至关重要。例如，AtICE1和MdCIbHLH1可以提高拟南芥和苹果的耐冷胁迫能力［15］；bHLH122可调节干旱、盐和渗透胁迫的抗性，并提高拟南芥中的细胞ABA水平［16］；bHLH104和MdbHLH104可以提高拟南芥和苹果对铁缺乏的耐受性［14，17］；AtMYC2通过正向调节拟南芥干旱响应基因RD22的转录来提高抗旱性［18］。AtbHLH112是一种转录激活因子，可介导脯氨酸的生物合成和清除活性氧（ROS）的途径，从而增强非生物胁迫的耐受性。 OsbHLH148是AtMYC2的同系物，可提高水稻的耐旱性［19］；NtbHLH123通过调节烟草中的NtCBF基因和清除ROS来提高耐寒性［5］；MdbHLH3可调节家蝇在低温下的花色苷积累［20］，PebHLH35通过调节气孔密度和气孔孔径来提高植物对干旱的耐受性［21］；TabHLH1与小麦的渗透和养分胁迫有关［22］。此外，在拟南芥中从野生稻Oryza rufipogon中分离出的OrbHLH2的过表达提高了对盐胁迫的耐受性［23］。与野生植物相比，ABA胁迫强烈诱导了AtbHLH122基因，过表达AtbHLH122的转基因植物对NaCl胁迫表现出更大的抗性［16］。通过盐处理诱导了小麦bHLH转录因子TabHLH39，并提高了小麦的盐胁迫耐受性［24］。此外，研究表明，bHLH家族基因在番茄抗黄叶卷曲病中发挥着重要作用［25］。

番茄（Solanum lycopersicum L.）为管状花目茄科番茄属一年生或多年生草本植物。其因具有重要的经济价值而受到人们的普遍喜爱，是全世界栽培较为广泛的蔬菜。然而，番茄在生长过程中常受到多种环境胁迫的不利影响，如干旱、高温、低温以及病毒病等。尤其番茄黄叶卷曲病可能对其造成毁灭性的损伤。尽管已经在植物生长发育和非生物胁迫耐受性的背景下证明了多个bHLH基因在几种植物中的作用［12-14］，且在番茄中已鉴定出约158种bHLH［26］，但尚未对其大多数功能进行研究，有研究表明SlbHLH095参与果实成熟的调节，影响乙烯敏感性和RIN靶向番茄中的多种代谢［27］。因此，笔者通过基因克隆与生物信息学分析报道了番茄bHLH077基因的基本结构特征，通过实时荧光定量检测了该基因在不同胁迫下（干旱、低温、盐与病毒）的表达模式，了解该基因的分子结构和生物学功能，旨在为今后使用转基因技术提高番茄抗逆性奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用材料种植于甘肃农业大学生科院试验基地，以番茄（金鹏1号）作为试验材料。将100粒种子浸入温水中，在55  ℃无菌水中放置20 min，然后转移到28 ℃室温水中4 h，然后在28 ℃暗室中发芽1 d。将发芽的种子播种在带有底物（蛭石∶珍珠岩∶园土 = 1∶1∶1）的50孔育苗盘中。播种后，将种子放入光箱中生长［相对湿度70％，光照/黑暗16 h/8 h；白天/晚上28 ℃/18 ℃；光照强度190～600 μmol/（m2·s）］。当番茄幼苗长到四叶一心时，将其进行胁迫处理。低温处理：在4 ℃下进行处理。盐胁迫：100 mmol/L NaCl。干旱处理：20% PEG。在胁迫处理后的0、2、4、8、12和24 h取番茄幼苗的根、茎和叶。接种黄化卷叶病毒：采用农杆菌介导的方法接种黄化卷叶病毒，在接种后10、20、30 d取番茄幼苗叶片，进行3个独立的生物学重复，每个重复包含3～6个单独的番茄植株样品。样品液氮速冻后于-80 ℃冰箱保存备用，用于后期RNA提取，反转录及目的基因的克隆、生物信息学分析及qRT-PCR分析。

1.2 方法

1.2.1 SlbHLH077基因克隆。

在番茄基因组数据库中下载SlbHLH077基因的编码序列（coding sequence，CDS），设计特异性引物（表1），以番茄幼苗cDNA为模板，利用特异引物 SlbHLH077-F-KpnⅠ 和 SlbHLH077-R-SalⅠ，扩增目的基因，通过琼脂糖凝胶电泳检测目的基因，通过胶回收试剂盒（天根），对目的基因进行纯化回收，将纯化后的目的片段连接至 T载体，利用热激转化法转入DH5α大肠杆菌（Escherichia coli），通过蓝白斑筛选，获得阳性克隆，进行菌液PCR检测并送天启公司测序，合适序列用于后期序列分析。