乌梅对柱状黄杆菌抑菌效果研究

柱状黄杆菌（Flavobacteriumcolumnare）广泛分布于土壤和淡水环境中，是一种严格需氧的革兰氏阴性菌，隶属于拟杆菌门、黄杆菌纲、黄杆菌目、黄杆菌科，其形状呈杆状或球杆状，以产生黄色色素为特征，具有滑动能力和团聚性，是一种常见鱼类病原菌[1]。鱼类在养殖过程中极易感染柱状黄杆菌而暴发细菌性烂鳃病[2]。有报道指出，每年全球因感染柱状黄杆菌而引起鱼类死亡所造成的经济损失数目巨大[3]，以前常使用化学药品防治烂鳃病4，但其效果不明确且容易造成化学残留，对水生生物以及人类健康有不好的影响；疫苗法则对操作手法要求较高，操作不当时特别容易造成鱼类应激死亡[5]，且对人工需求量较高；抗生素因其在生物体内的残留，被明令禁止添加在饲料中[6]

随着限抗令的颁布和实施，急需寻找抗生素的替代品来提高养殖业的经济效益，益生菌、酶制剂、中草药等均可作为抗生素的替代品。中草药具有毒副作用小、无残留、对环境友好、成本低、无抗药性的特点[7。用中草药防治鱼病，不但可以解决药物残留问题，而且还具有提高鱼体免疫功能等作用，从而确保鱼肉产品质量安全[8]

乌梅（Fructusmume）是我国传统的药食同源中药，俗称酸梅、黄仔等，为蔷薇科梅的近成熟果实，主产于我国南方地区，包括四川、云南、贵州、安徽、福建等地，栽培资源丰富，呈椭圆形，表面乌黑色，气微，味极酸，其主要化学成分有黄酮、有机酸、萜、多糖等[9]。乌梅具有抑菌、抗氧化、抗肿瘤等生物学功能[10]。研究表明，乌梅能够对嗜水气单胞菌[11]、假单胞菌[12]等水生动物病原菌具有良好的抑菌效果，但在国内外有关乌梅抑制柱状黄杆菌的研究还很少。因此，该试验主要考察乌梅对柱状黄杆菌的抑菌效果，探讨乌梅是否抑制柱状黄杆菌，并初步探明其最低抑菌浓度，以期为乌梅用于防治柱状黄杆菌引起的鱼类细菌性烂鳃病提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料乌梅产自广西，购自古庆堂旗舰店。柱状黄杆菌，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌株编号为CGMCC1.1236820210106。主要仪器包括无菌操作台（Telstar-BIOIIA）、漩涡振荡仪（HX-C）、高温高压灭菌锅（SANYO-PHCBI-MLS3750）、恒温培养箱（上海一恒BPH-9042）低温离心机（ 、鼓风干燥箱（101-OA）、可见光分光光度计（SELECTR-VR-2000）、显微镜（E100） pH测试笔（SJC-TDS-3）。

1.2 试验方法

1.2.1R2A培养基的配制。参照中国普通微生物菌种保藏管理中心提供的R2A培养基配方配制液体培养基，称取葡萄糖 0.50g 可溶淀粉 0.50g 示蛋白陈 0.50g 、酵母浸膏0.50g 、酸水解酪素 0.50g、丙酮酸钠 ，溶解于 1000mL 蒸馏水中，调节pH至7.2后 灭菌 20min 。

1.2.2菌种的复活。先用 75% 乙醇脱脂棉对安瓿瓶外表面进行消毒，用火焰加热安瓿瓶顶端，用少量无菌水滴加至刚受热的安瓿瓶顶端使之破裂，用镊子敲下破裂的安瓿瓶顶部，再吸取灭菌的R2A液体培养基 0.3mL ，注入安瓿瓶内，轻轻振荡，并用移液枪反复吹打，使冻干菌体完全溶解。吸取全部菌悬液，移植于液体培养基试管中，在培养箱中 条件下培养 72h 。

1.2.3菌种的传代培养。参照黄锦炉等[13]研究的Shieh配方，按照蛋白陈 、酵母浸膏 0.30蒸馏水 配制，溶解后用 调节 pH至7.2，分别按0.2ug/mL，20U/mL的浓度加人妥布霉素和多黏菌素，并在 下进行高温灭菌 20min ，倒平板。在无菌操作条件下，将上述复活的菌液接种在平板上，进行传代培养，用于平板抑菌试验。

1.2.4乌梅的熬制。称取 15g 烟熏乌梅肉（烟熏乌梅去核），加 400mL 蒸馏水熬制1h，蒸发浓缩至 150mL ，即浓度为 的乌梅水煎剂，移至锥形瓶，密封灭菌，冷却后放置冰箱冷藏， 保存备用。

1.2.5液体培养基试管抑菌试验

1.2.5.1未调节pH的液体培养基试管抑菌试验。参照“1.2.1"R2A培养基配方制作液体培养基。按照乌梅水煎剂与培养基 1：8＼ 、1：16＼ 、1：32＼ 、1：64＼ 、1：128＼ 、1：256的比例制作乌梅水煎剂液体培养基，分别加入 100uL相同浓度的柱状黄杆菌菌液，在恒温培养箱中 培养 后观察。然后用各浓度比例乌梅水煎剂培养基作为对照组，借鉴麦氏比浊法在 测定各比例菌液的吸光度，以判定柱状黄杆菌是否生长。

1.2.5.2未调节pH液体培养基的pH测定。使用pH测试笔对上述各浓度比例液体乌梅水煎剂培养基进行pH测定。分别配制pH为 4.00，6.86，9.18 的标准液，将pH测试笔分别伸入标准液中进行校准，伸入不同标准液前用蒸馏水清洗笔头电极，并用擦镜纸擦干。校准后，将pH测试笔伸人各液体培养基，轻轻晃动待数值稳定后进行读数。

1.2.5.3调pH至7.2的液体培养基试管抑菌试验。将 1：8 的液体药物培养基的pH调节至7.2，然后用培养基等比稀释至 1：16，1：32，1：64，1：128，1：256 ，再按照“1.2.5.1"的操作步骤再次进行抑菌试验，观察结果。

1.2.6平板抑菌试验。按"1.2.1"R2A配方制作培养基，分别按照 0.2，0.4，0.6mg/mL 加人乌梅水煎剂，调节pH至7.2，并按 1.5% 的比例加入琼脂，121℃条件下灭菌 ，倒平板，制备出含有不同浓度的乌梅中药平板。将平板上复活的菌落稀释至 CFU/mL，分别取稀释的菌液100uL接种涂布在各浓度的中药平板上，在培养箱中 条件下培养 72h ，观察拍照，并对菌落计算，计算抑菌率：

抑菌率 （对照组的菌落数-试验组的菌落数）/对照组的菌落数 ？×100%

2 结果与分析

2.1柱状黄杆菌复活液体培养基中观察到培养基变浑浊，有连在一起的白色絮状物。如图1所示，固体培养基上的菌落形态为淡黄色点状，菌落边缘不整齐，呈假根状向外延伸。如图2所示，经过革兰氏染色后观察为红色，确认是革兰氏阴性菌，在液体培养基中为长杆状，在固体培养基上稍短，与黄锦炉等[13的研究结果一致，均符合柱状黄杆菌形态特征，可以用于后续抑菌试验。

2.2 液体抑菌试验

2.2.1乌梅对柱状黄杆菌的抑菌效果。由表1可知，在乌梅水煎剂添加比例为 1：128 时，吸光度为0，且肉眼观察到试管完全透明，证明柱状黄杆菌没有生长；添加比例在 1：256 时吸光度较大，肉眼可以观察试管明显浑浊，证明柱状黄杆菌生长良好。由此可知，未调节pH的液体药物培养基的最低抑菌添加比例为1：128，即最低抑菌浓度为 0.775mg/mL 。