青海地区藏茴香种质资源遗传多样性的ISSR分析

ISSR Analysis of Genetic Diversity of Carum carvi L. Germplasm Resources in Qinghai Region

ZHENGMing-xian，YANGLi-na，HENNing-dongetal（ColegeofAgrcultureandAnimalHusbandryQinghai Universityining， Qinghai 810016）

AbstractObjective]Toexplorethegeneticdiversityandgeneticelationshipof15Carumcari germplasmsinQinghairegionandtopro vide theoretical support for the artificial cultivation of carvivarieties.[Method] DNA from 149 fresh leaves of C . carvi was extracted by modifiedCTABmethod，andthn10igeffciencISprimerswereusedfomleularlabeling.Result]Atotalof8412plymoicbnd were obtained，the total polymorphism ratio was 90.21% ，the average Nei’s gene diversity index （ ）was O.5O，the average Shannon’s information index （I） was O.75，and the genetic similarity coefficient among C . carvi germplasm was 0.84-0. 97. The genetic diversity index ）， intra-population genetic diversity index（ ），gene differentiation coefficient （ ）and gene flow （ ）were0.23，0.17，0.26 and1.42，respectively.Te5gerplasswerdvidedintothecategois.e49C.carindivualseredividdinto6ategories.Cocusione germplasm of wild .carvi in Qinghaiareahasrich geneticdiversityandthere isextensivegeneexchange between germplasms，ndthis gene exchangeshowsacertain gradual difusion lawinthesame direction intheregion，andtherichgenetic diversityof wild C . carvi in Qinghai area comes from the differences between individuals.

Key WordsCarum carvi L. ；Germplasm resource；ISSR molecular marker；Genetic diversity

藏茴香（CarumcarviL.），常生长于路旁、草原、山沟、河滩、山坡等处的二年或多年生草本植物，属伞形科（Umbellif-erae）葛缕子属（Carum），又名葛缕子，在青藏高原俗称郭鸟、马缨子[1]，种子呈长卵圆形，表面有纵棱，种皮深褐色[2]。藏茴香因其全草富含挥发性成分，气味独特，其种子提取精油具有多重作用，是传统民俗佐料及藏药资源之一，具有重要的药用价值及民俗文化价值[3-7]。藏茴香在世界范围内均有分布，在北欧、非洲、俄罗斯等地人工种植当地育成品种及品系[8-9]，在我国东北、华北、西北、四川、西藏等地的藏茴香种质基本处于未被开发的完全野生状态[10]，藏茴香种质间亲缘关系不明确，因此对藏茴香种质开展系统的鉴定和亲缘关系分析十分必要，而传统形态学等方面的亲缘关系鉴定存在易受环境变化、地理因素限制等影响结果准确性。

随着现代分子遗传学及生物学的飞速发展，包括ISSR（inter simple sequence repeat） SSR（simple sequence repeat）、SNP（single nucleotide polymorphism）、RAPD （random ampli-fied polymorphic DNA）SRAP（sequence-related amplified pol-ymorphism）在内的DNA分子标记被大量开发，且广泛应用于植物遗传特性[1]、亲缘关系分析[2]和遗传多样性研究[13]

ISSR标记技术无需事先获得序列信息和引物设计，具有操作简单、稳定性好、多态性高、广泛试用等特点[14]，可以用于藏茴香种质亲缘关系分析。

青藏高原地区具有丰富的藏茴香种质资源，这些种质间的亲缘关系目前尚不清楚，国内对于青海地区藏茴香种质间亲缘关系方面的研究鲜见报道，因此需要更准确和可靠的方法对其进行鉴定和亲缘关系分析。该研究利用ISSR分子标记技术对15个不同生长地藏茴香种质的遗传多样性进行分析和评价，了解藏茴香种质的遗传特点和亲缘关系，以期为藏回香种质资源保护和有效开发提供理论支撑。

1材料与方法

1.1试验材料藏茴香种质材料为2018—2019年采自青海省（编号为Q1＼～Q13）、甘肃（编号为G1）、四川（编号S1）共15个不同居群（地区）的野生藏茴香种子，各种质来源地详细信息见表1，藏茴香种质按居群划分并编号。2020—2021年种植于青海省互助县五十乡巴洪村的试验地（试验地海拔 ，年降水量 550.7mm ，年均温 ，无霜期 的积温 的积温 1452.4℃·d，土壤类型为黄黑土，土壤有机质含量2.52g/kg，pH7.9 ，耕作层 22cm ，全磷、全氮、全钾含量分别为 1.91，1.88，25.42g/kg ；碱解氮、速效钾和速效磷含量分别为118、168和 19.10mg/kg 。田间管理方法同当地常规，在藏茴香第一年营养生长期间，从15个藏茴香种质中分别随机选取9＼～10个健康单株（共149个单株）的完全展开叶片，用 冰袋保存，带回实验室备用。

1.2 试验方法

1.2.1藏茴香总DNA提取与检测。提取：藏茴香总DNA的提取采用周仙莉等[15提出的改良CTAB法。检测：藏茴香DNA样本的质量和浓度利用 1% 琼脂糖凝胶电泳及酶标仪（SpectraMax190）进行检测；保存： 超低温环境保存备用。

1.2.2PCR扩增。该研究从100个通用ISSR引物（UBC801＼～ UBC9OO，http：//www.biotech.ubc.ca/services/naps/primers/Primers.PDF）中，筛选到10个扩增条带清晰、多态性好的引物（表2）用于藏茴香种质的分析。参考田霞等[16]优化的藏茴香ISSR-PCR反应体系（25uL反应体系中，Taq酶 1.0U、0.6umol/L引物、Mg1.5mmol/LdNTPs0.2mmol/L，40ng 的DNA模板）进行PCR扩增。PCR反应程序：30次循环（ 5min 预变性， ；30s变性， S退火， 延伸， ）； 5min 延伸， 。PCR产物 保温。PCR扩增产物在 1% 琼脂糖凝胶板上进行电泳分析（ 电压，电泳时间 50min，0.5×TAE 电泳缓冲液），凝胶成像系统检测上记录扩增产物的大小。

1.3数据分析对所得ISSR分子标记扩增带谱，按照有无进行人工记录，无条带记为“0”，有条带记为“1”，在Excel中构建0、1数据矩阵。运行NTSYSpc2.10e进行遗传相似度、遗传距离计算和 UPGMA（unweighted pair-group method witharithmeticmeans）法构建聚类图进行亲缘关系分析和主成分分析；POPGENE32软件计算Nei’s基因多样性指数 、Shannon's信息指数 （I） ；MEGA64构建群体进化树。