广西鸭源H3N8亚型禽流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析

摘要  ［目的］了解广西水禽中分离到的H3N8亚型禽流感病毒的分子遗传进化特征。［方法］将从活禽市场采集的水禽棉拭子样品经处理后接种SPF鸡胚，应用血凝试验和血凝抑制试验对收取尿囊液进行血清学鉴定，然后对分离到的禽流感病毒进行全基因序列测定和遗传进化分析。［结果］血清学及HA和NA基因测序结果显示，该分离毒株为H3N8亚型禽流感病毒，命名为A/duck/Guangxi/446D28/2021（H3N8）。全基因遗传进化分析显示，其HA蛋白无连续碱性氨基酸插入，符合典型低致病性禽流感病毒的特征；NA蛋白出现耐药性氨基酸位点突变；该毒株8个基因片段在GenBank中比对分析结果显示，其同源性最高的毒株基本主要来自越南和位于我国候鸟迁徙路线上的宁夏及江西等省（区）。［结论］该分离株可能是不同亚型禽流感病毒通过相互基因交换所形成的基因重组体。

关键词  禽流感病毒；H3N8；水禽；基因重组

中图分类号  S852.65  文献标识码  A  文章编号  0517-6611（2024）01-0072-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.01.016

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Isolation， Identification and Genetic Evolution Analysis of Avian Influenza Virus H3N8 from Ducks in Guangxi

LI Meng， LI Dan， XIE Zhi-xun et al

（Guangxi Veterinary Research Institute， Guangxi Key Laboratory of Veterinary Biotechnology， Key Laboratory of China（Guangxi）-ASEAN Cross-border Animal Disease Prevention and Control， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Nanning， Guangxi 530001）

Abstract  ［Objective］ To understand the molecular genetic evolution characteristics of H3N8 subtype avian influenza virus isolated from waterfowl in Guangxi. ［Method］ The cotton swab samples collected from live poultry market were treated and inoculated into SPF chicken embryos. The collected allantoic fluid was serologically identified by hemagglutination test and hemagglutination inhibition test， and then the whole gene sequence and genetic evolution analysis of the isolated avian influenza virus were carried out. ［Result］ Serological HA and NA gene sequencing results showed that the isolated strain was H3N8 subtype avian influenza virus， named A/duck/Guangxi/446D28/2021 （H3N8）. Genetic evolution analysis of the whole gene showed that there was no continuous basic amino acid insertion in HA protein， which accorded with the characteristics of typical low pathogenic avian influenza virus. NA protein appeared drug-resistant amino acid site mutation;The results of comparative analysis of eight gene fragments of this strain in GenBank showed that the strains with the highest homology mainly came from Vietnam， Ningxia and Jiangxi provinces， which are located on the migratory route of migratory birds in China. ［Conclusion］ The isolated strain may be a gene recombinant formed by gene exchange among different subtypes of avian influenza viruses.

Key words  Avian influenza virus;H3N8;Waterfowl;Gene recombination

基金项目  广西重点研发计划项目（桂科AB21076004））；广西自然科学基金项目（2022GXNSFAA035445，2021GXNSFBA196031）；“广西八桂学者”专项（桂科专项21-1）。

作者简介  李孟（1981—），男，河南南阳人，正高级兽医师，博士，从事病原分子生物学研究。

*通信作者，研究员，从事动物疫病防控研究工作。

收稿日期  2023-01-13

流感病毒（influenza virus）属于正黏病毒科流感病毒属［1］。根据流感病毒表面的血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）2种蛋白可分为多个不同的亚型，目前已知HA亚型有18种，NA亚型有11种［2-3］。H3亚型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）属于低致病性AIV（LPAIV），是LPAIV中的主要亚型之一。H3亚型AIV不仅引发犬流感、猪流感和马流感等疾病，还可以通过基因重组跨越种属屏障感染人类［4-5］。1968年香港流感病毒（H3N2）大流行引发人们对H3亚型流感禽源重配毒株的重视［6］。研究表明，H3亚型AIV在LPAIV流行病学调查中具有较高的分离率，H3亚型AIV主要亚型组合包括H3N2、H3N3、H3N6和H3N8［7-8］。

H3N8亚型AIV主要存在于野生水禽体内，通常分为禽源与马源，不仅可以感染禽类，还可能感染一些哺乳动物。Scholtens等在1963年首次报道了马感染H3N8亚型AIV，而且禽源A/Equine /Jilin /1963（H3N8）流感病毒曾引起我国黑龙江省马流感的暴发，并造成马匹死亡［9］。研究表明，马源H3N8亚型AIV不仅感染马、骡和驴，还能够引起犬和猪感染发病［10］。Anthony等报道了H3N8亚型AIV引起海豹死亡的事件［11］。近年来，H3N8亚型AIV在我国野鸟和活禽市场中被分离到，2021年起引起鸡群发病的新型H3N8亚型AIV也在我国南方鸡群中被监测到［12-13］。2022年4月，我国河南省报道了全球首例人感染H3N8亚型AIV［14］事件。2022年5月，我国湖南省发现全球第二例人感染H3N8亚型AIV病例，即一名儿童与禽类同时感染H3N8亚型AIV的病例［15］。上述研究表明，H3N8亚型AIV的宿主范围在不断地扩大，可以跨越种属屏障感染哺乳动物和人类，严重威胁人类公共卫生安全。

广西地处热带和亚热带，毗邻流感疫情复杂的越南，还位于候鸟路线上，同时具备流感病毒生存与传播的天然条件，被国内外众多学者描述为“流感起源中心”之一［16］。每年大量的候鸟携带流感病毒经过广西迁徙，对广西流感的流行及防控带来巨大影响［17］。近年发生的人感染H3N8亚型AIV事件及H3N8亚型AIV引起鸡群发病的报道引发人们对H3亚型AIV的广泛关注。为进一步了解广西H3亚型AIV的遗传进化情况，笔者对从健康鸭中分离到的一株H3N8亚型AIV进行了全基因序列测定和遗传进化分析，以期为广西H3N8亚型AIV的防控提供理论支撑。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  样品与鸡胚。

2021年从广西南宁地区不同活禽交易市场采集鸭和鹅的口咽及泄殖腔棉拭子样品，所有样品存放在含有4种抗生素的保存液中。样品经低温运输至广西兽医生物技术重点实验室存放于-80 ℃冰箱备用。1龄SPF鸡胚购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司，自行孵化至9～11日龄用于病毒分离鉴定。

1.1.2  主要试剂。

RNA核酸提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、DH5α大肠杆菌化学感受态细胞和平末端连接载体试剂盒pEASY-Blunt Cloning Kit均购自北京全式金生物技术有限公司；DNA Marker 1 000 bp、高保真PCR Mix、Uni-12随机引物、dNTP、cDNA第一链合成用的MLV反转录酶及RNA酶抑制剂购自宝生物工程（北京）有限公司；唾液酸酶6’-Sialyllactose-PAA-biotin（6’SL-PAA）和3’-Sialyllactose-PAA-biotin（3’SL-PAA）均购自GlycoTech公司；TMB 过氧化物酶（HRP）底物的即用型溶液购自北京天根生物科技有限公司；Streptavidin-HRP过氧化物酶购自美国R&D systems公司；其余试剂购自商业公司，均为国产分析纯。

1.1.3  引物设计及合成。

参照相关文献［18］及GenBank中已发表的H3亚型AIV全基因序列，利用Premier 7.0和Oligo 6.0软件设计针对H3亚型AIV基因组8个节段的特异性引物用于扩增A/duck/Guangxi/446D28/2021（H3N8）的全基因，引物由华大基因科技有限公司合成。

1.2  方法

1.2.1  病毒的分离鉴定及纯化。

将南宁市活禽交易市场采集到的家禽棉拭子样品放置在低温保藏箱中快速转运至实验室进行处理，处理后的样品上清液接种10日胚龄SPF鸡胚，每个样品0.2 mL/枚分别接种2枚鸡胚，在35 ℃条件下孵化96 h；采集24～96 h死亡和未死亡鸡胚尿囊液，用血凝试验（HA）和血凝抑制试验（HI）对其进行血清学鉴定，根据鉴定结果初步确定样品中所含禽流感病毒的HA亚型。将确定为H3亚型AIV病毒株尿囊液接种于鸡胚成纤维细胞（CEF），参照通过空斑纯化进行连续3轮的克隆纯化，再接种SPF鸡胚对纯化后的H3亚型毒株进行增殖并用HA试验验证，将收获的尿囊液置于-80 ℃保存备用。

1.2.2  病毒RNA的提取与RT-PCR扩增。

使用RNA抽提试剂盒按照说明书提取收获的病毒尿囊液总RNA，利用流感病毒Uni-12通用引物按照试剂盒说明书进行cDNA第一链的合成。根据不同目的基因引物特异性设计不同的PCR扩增程序，分别对8个基因片段进行PCR扩增。扩增产物采用1.0%琼脂糖凝胶电泳对目的片段进行检测和纯化。