涮辣和昆明皱皮椒Kas生物信息学及表达分析

摘要  ［目的］探究涮辣与昆明皱皮椒3-氧酰基［酰基载体蛋白］还原酶（3-oxoacyl-［acyl-carrier-protein］synthase，Kas）的差异。［方法］特异性扩增了Kas，并进行了生物信息学分析。利用荧光定量 PCR 及酶活性测定方法测定了不同发育时期、不同环境及6种外源因子处理下 Kas 表达量及酶活性。［结果］扩增得到的涮辣和昆明皱皮椒 Kas 基因均为 1 467 bp，编码 488个氨基酸。Kas为脂溶性、亲水性的稳定蛋白，无信号肽与跨膜结构，主要定位于质膜。在不同发育阶段，2种辣椒 Kas 表达水平与酶活性的趋势均为先升高后急剧降低，且在大部分发育阶段均表现为露地栽培高于大棚栽培；同一环境条件下，涮辣 Kas 表达与酶活性整体高于昆明皱皮椒；且不同外源物质在一定时间内可影响涮辣 Kas 的表达，其中MeJA和SA处理对Kas表达量影响较大。［结论］涮辣与昆明皱皮椒 Kas 基因和蛋白特性相似，但存在差异，在辣椒生长发育、环境和外源物质响应方面有重要功能。

关键词  涮辣；昆明皱皮椒；3-氧酰基［酰基载体蛋白］还原酶（Kas）；生物信息学

中图分类号  Q943.2  文献标识码  A  文章编号  0517-6611（2024）01-0090-08

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.01.019

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Bioinformatics and Expression Analysis of 3-oxoacyl-［acyl-carrier-protein］Synthase （Kas） from Capsicum chinense and C. annuum

ZHOU Hui-dan， LI Meng-juan， WU Rui et al

（College of Landscape and Horticulture， Yunnan Agricultural University， Kunming， Yunnan 650201）

Abstract  ［Objective］To investigate the difference of 3-oxoacyl-［acyl-carrier-protein］synthase （Kas） between Capsicum chinense and C. annuum

. ［Method］Kas was specifically amplified and bioinformatic analysis was performed.Kas expression and enzyme activity were determined by quantitative PCR and enzyme activity assay under different development stages， different environments and six exogenous factors. ［Result］The Kas gene of Capsicum chinense and C. annuum was 1 467 bp， encoding 488 amino acids. Kas is a lipopolysaccharide， hydrophilic and stable protein with no signal peptide and transmembrane structure， which is mainly located in the plasma membrane. At different developmental stages， Kas expression level and enzyme activity of both kinds of capsicum were increased first and then decreased sharply， and in most developmental stages， they were higher in open field than in greenhouse cultivation. Under the same environmental conditions， Kas expression and enzyme activity in Capsicum chinense were higher than those in C.annuum. In addition， different exogenous substances could affect Kas expression in Capsicum chinense in a certain period of time， among which MeJA and SA treatments had a greater effect on Kas expression. ［Conclusion］The Kas gene and protein characteristics were similar but different between Capsicum chinense and C. annuum，which had important functions in pepper growth and development， environment and foreign substance response.

Key words  Capsicum chinense;C.annuum;3-oxoacyl-［Acyl-carrier-protein］synthase （Kas）;Bioinformatics

基金项目  国家自然科学基金项目（32160708）；云南省科技计划项目（202102AE090005，202205AR070001）。

作者简介  周慧丹（1998—），女，云南昆明人，硕士研究生，研究方向：蔬菜遗传育种。

*通信作者，教授，博士，从事园艺植物生物学研究。

收稿日期  2023-02-06

辣椒（Capsicum annuum L.）为茄科辣椒属的一年生或者有限多年生的草本植物。辣椒在全世界种植广泛，我国是辣椒的生产大国，种植历史已有300余年。辣椒是维生素和色素的来源之一，常被用作蔬菜、香料［1］。涮辣是云南省特有的种质资源，主要分布于云南省的德宏、保山和西双版纳等地，喜温耐热，成熟果实色泽艳丽鲜红，最主要的是其辣度可与墨西哥的魔鬼椒以及印度的断魂椒相媲美，做菜时可在汤里涮涮，整锅汤就会有辣味，故取名为“涮辣”［2-4］。辣椒的特点是味道辛辣，这是由于存在一组被称为辣椒素的化合物，该类物质主要在辣椒属果实的胎盘中特异合成［5］。这些次生代谢物具有一系列的生物活性和工业应用，例如，辣椒素对于植物保护抵御一些食草动物、昆虫和微生物是重要的，并且可以作为鸟类传播种子的选择剂［6-7］。辣椒素类物质具有多种药理作用，已被用于制造个人化学防御装置以及用于缓解关节炎、疱疹或肿瘤切除术后疼痛的护垫和乳膏等［8-12］。辣椒素类物质只在辣椒属中合成和积累，研究辣椒中辣椒素的形成机制，对于提高辣椒素产量具有重要意义。

辣椒素主要在辣椒果实的胎盘组织中合成［13］，并在开花后10～20 d开始积累，20～40 d增加，达到最大值后递减［14］。辣椒素是通过源自类苯丙酸途径的香草胺及源自支链脂肪酸途径的一系列支链脂肪酸部分缩合而成的。苯丙氨酸是苯丙素生物合成的主要前体，而缬氨酸或亮氨酸是支链脂肪酸合成的前体底物，最终用于辣椒素生物合成［15］。由于植物的遗传组成不同，辣椒果实可以表现出不同程度的辣味，但是辣味也依赖于果实的发育阶段和辣椒生长的环境条件［16-17］。在辣椒素生物合成途径中，3-氧酰基（酰基载体蛋白）还原酶（Kas）位于脂肪酸合成支链上。Kas 与酰基转运蛋白酶（Acl）和 ACP-酰基硫酯酶（FatA）组成了脂肪酸合酶（FAS）复合体，催化脂肪链的延伸［18］。Aluru等［19］从辛辣型辣椒品种Habanero果实的胎座中筛选到8个编码辣椒素生物合成活性物质的cDNA克隆，并发现其中3-酮酯酰-ACP合成酶基因（Kas）、依赖磷酸吡哆醛的转氨酶基因（pAmt），乙酰辅酶A转移酶基因（4A1）是胎座特异表达基因。Del等［20］基于基因沉默（VIGS）法沉默Comt、pAmt和Kas基因，发现沉默后的辣椒果实中辣椒素积累减少，由此证实了辣椒素的积累与Kas等基因的表达相关。利用病毒介导的基因沉默技术研究了Comt、pAmt 和Kas基因表达水平与辣椒素的积累量关系。任何一个基因Comt、pAmt 和 Kas的沉默都会导致辣椒素含量的急剧下降。雷建军等［21］获得了5个辣椒转录因子，同时利用基因沉默等技术解释了pAMT、Kas等基因对辣椒素含量的正向指导作用。辣椒素的合成积累与环境条件也密切相关，有研究表明，在干旱、高温、光照条件下辣椒素类物质的积累增加［22-25］。Medina-Lara等［26］研究表明，氮肥显著增加了辣椒的生长和果实产量，同时辣椒素含量也维持在较高水平。Tewksbury等［27］在对野生辣椒调查中指出，总辣椒素含量随着海拔的升高而显著增加。大量研究表明，一定浓度的外源激素处理能显著提高辣椒果实中辣椒素类物质的积累。较低浓度的水杨酸和茉莉酸甲酯喷施有利于辣椒素和二氢辣椒素的积累［28］，脱落酸处理能显著提高辣椒素的含量，并在各时期都与对照有显著差异［29］。

涮辣的辣椒素含量极高，达19.814 8 mg/g，二氢辣椒素含量6.107 4 mg/g，辣度级别超过10级，且涮辣辣度为昆明皱皮椒的42.4倍［30］。笔者选取辣椒素积累差异较大的2个云南本地特色品种：涮辣和昆明皱皮椒作为试验材料，研究辣椒素的合成。鉴于Kas在辣椒素生物合成方面的重要作用，且目前国内关于涮辣辣椒素合成与Kas酶的研究较少，为进一步探究涮辣辣椒素积累高的原因，以昆明皱皮椒为参照，从涮辣和皱皮椒中分离并鉴定了2条Kas基因，运用生物信息学方法分析Kas特性；利用qPCR方法测定了不同发育时期、环境条件下Kas表达水平，旨在探究涮辣与昆明皱皮椒Kas基因和酶的差异，与不同发育时期、环境条件和外源物质处理下Kas表达规律，并为解释Kas在云南特色涮辣辣椒素积累方面提供理论借鉴与参考。

1  材料与方法

1.1  材料

涮辣和昆明皱皮椒都来自云南农业大学园林园

艺学院番茄辣椒实验室，在后山露天和大棚2种环境条件下栽培。以花后每10 d为1个发育时期，选择7个发育时期的辣椒果实为试验材料，分别提取2种辣椒的RNA，再反转录为cDNA后进行Kas基因克隆，以下Kas 1为涮辣Kas，Kas 2为昆明皱皮椒Kas。

1.2  方法

1.2.1  Kas基因的分离与鉴定。

在NCBI数据库下载已有的CaKas基因序列，并根据序列设计引物（表1），委托北京擎科生物技术有限公司合成。使用北京华越洋生物技术有限公司的RNA提取试剂盒提取涮辣和昆明皱皮椒的总RNA，利用YEASEN公司的反转录试剂盒合成第一链cDNA。以cDNA为模板，使用上述引物进行PCR特异性扩增，凝胶电泳检测后回收特异性PCR产物送北京擎科生物有限公司测序，得到目的片段序列。

1.2.2  涮辣和昆明皱皮椒的Kas基因特性及蛋白特性分析。