QuEChERS净化-高效液相色谱-串联质谱法测定红枣中5种植物生长调节剂

摘要 ［目的］建立1%甲酸-乙腈提取结合QuEChERS净化，高效液相色谱-串联质谱法同时测定红枣中5种植物生长调节剂的方法。［方法］比较不同提取试剂、净化材料等对提取净化效果的影响。在ESI源正/负离子模式下，多反应监测（MRM）模式采集数据，进行定性和定量分析。［结果］5种植物生长调节剂在1～50 ng/mL质量浓度范围内线性关系良好（R2>0.999），方法检出限和定量限分别为0.1～0.2和0.3～0.6 μg/kg。空白红枣3个不同的添加水平回收率为82.5%～106.1%，相对标准偏差（RSD）为1.0%～8.4%。通过对市售红枣样品检测，能够准确测定红枣中植物生长调节剂水平。［结论］该方法简单、快速、准确可靠，适用于红枣中5种植物生长调节剂的快速测定。

关键词 红枣；植物生长调节剂；高效液相色谱-串联质谱法；QuEChERS

中图分类号 TS255.7  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2024）14-0165-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.14.036

Determination of Five Plant Growth Regulator in Red Jujube by QuEChERS Purification High-performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

LU Li-liang， CHEN Yong-fa， ZHANG Jin-lei et al

（Xinjiang Academy of Agricultural and  Reclamation Science/Food Quality Inspection and Testing Center（Shihezi），Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Shihezi，Xinjiang 832000）

Abstract ［Objective］A method was developed for the simultaneous determination of 5 plant growth regulators （PGRs） in red jujube by using 1% formic acid-acetonitrile extraction and QuEChERS cleanup with high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS） detection. ［Method］The effects of different extraction reagents， purification materials， etc. on the extraction and purification efficiency were compared. Data were collected in multiple response monitoring （MRM） mode in ESI source positive/negative ion mode for qualitative screening and quantitative analysis. ［Result］The linear relationship of the five plant growth regulators was good within the mass concentration range of 1-50 ng/mL （R2>0.999），the detection and quantification limits were 0.1-0.2 and 0.3-0.6 μg/kg， respectively. The recovery rates of three different addition levels of blank red jujube were 82.5%-106.1%， the relative standard deviation （RSD） was 1.0%-8.4%.Through the detection of actual samples in the market， the level of PGRs in red jujube could be accurately quantified. ［Conclusion］The method is simple， rapid， accurate and reliable， and suitable for the rapid determination of five plant growth regulators in jujube.

Key words Red jujube;PGRs;HPLC-MS/MS;QuEChERS

作者简介 鲁立良（1981—），男，安徽颍上人，高级实验师，博士，从事食品安全与工程研究。

收稿日期 2023-09-20

植物生长调节剂（PGRs）是人工合成或从微生物中提取的与植物激素具有相似生理和生物学效应，能够调节植物生长发育的有机化合物，也称为植物外源激素［1-2］，如赤霉素、多效唑、矮壮素、萘乙酸、2，4-D等。在农业生产中，使用适量的PGRs，可以有效调控农作物的生长发育过程，促进农作物稳产增产、改善品质、增强作物抗逆性等［3-4］。但过量使用可能会使农作物过快生长，或生长受到抑制，严重的可能会导致农作物死亡，严重影响农产品质量；另外，不规范的使用还容易造成土壤和水体等的环境污染，同时易导致PGRs在农作物中的残留，并通过食物链的传递和富集进入人体，给人们的健康带来巨大危害。因此，PGRs的使用已经引起了广泛的关注［5-7］。

红枣含有丰富的维生素、矿物质和其他营养物质，具有很高的营养和药用价值。在红枣的种植生产过程中会使用到多种PGRs，由于使用不规范容易导致PGRs在红枣中残留。为了减少潜在的健康风险，急需对红枣中PGRs进行风险调查。目前，用于检测PGRs含量的标准相对较少，前处理过程复杂，耗费大量的有机试剂，且红枣含有大量的糖分和营养物质，基质十分复杂，PGRs的提取和净化成为红枣中PGRs残留分析的关键。PGRs的提取主要使用有机溶剂，如甲醇［8］、乙腈［9］等，甲醇的极性相对较小，提取的共萃物较多；乙腈提取时回收率高、干扰物较少，是广泛使用的有机污染物提取试剂；PGRs净化方法主要有固相柱净化法和 QuEChERS［10］等，固相柱净化法需要对固相柱进行活化，使用较多的有机试剂，QuEChERS法具有操作简便、分析速度快、回收率高、试剂用量少等优势，已广泛应用于有机污染物的净化。PGRs的测定方法主要有气相色谱法（GC）、气相色谱-质谱法（GC-MS）、高效液相色谱法（HPLC）、高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）和离子色谱法（IC）等［11-13］。GC和GC-MS通常要进行待测物衍生化，操作复杂；HPLC灵敏度较低，难以实现确证分析；HPLC-MS/MS具有高特异性和高灵敏度，具有定性、定量分析准确的特点，适合复杂样品中痕量成分的定性定量分析［14-15］。

目前，红枣中的PGRs检测存在一定的不足，建立一种快速、高效、准确度高的检测方法，对红枣中的PGRs风险监控具有重要的意义。该研究采用有机溶剂提取、QuEChERS方法净化处理，结合HPLC-MS/MS同时测定鲜枣中5种植物生长调节剂，同时，通过对市售鲜枣的实际检测，验证方法的准确性，获得了低检出限、快速、简便的PGRs检测方法，为市场监督检验提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

AB SCIEX QTRAP5500+高效液相色谱-串联质谱仪（美国AB公司）；N-EVAPTM112氮吹仪（美国Organomation Associates公司）；3-30K高速冷冻离心机（美国Sigma公司）；IKA MS3涡旋混合器（德国IKA公司）；SBL-30PT超声波恒温清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；IQ7000超纯水仪（美国MilliQ公司）。

5种标准品：赤霉素、多效唑、矮壮素、萘乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D），纯度均大于97%，德国Dr.Ehrenstorfer公司。乙腈（色谱纯）；甲醇（色谱纯）；甲酸（色谱纯）；无水硫酸镁（分析纯）；无水乙酸钠（分析纯）；C18（分析纯）。

1.2 标准溶液的配制

1.2.1

标准品储备液。分别准确称取适量的赤霉素、多效唑、矮壮素、萘乙酸和2，4-D于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成1.0 mg/mL标准储备液，于-18 ℃储存。

1.2.2

混合标准品工作液。准确量取“1.2.1”各标准品储备液，于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，配制成100.0 ng/mL混合标准品中间液，于-18 ℃储存。

1.3 仪器条件

1.3.1 色谱条件。色谱柱为ACQUITY HPLC BEH C18（1.7 μm，100 mm × 2.1 mm，美国Waters公司）；流动相A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈；流速0.30 mL/min；进样量5 μL，柱温30 ℃。梯度洗脱，洗脱程序见表1。

1.3.2

质谱条件。离子化模式为电喷雾离子源（±ESI源），扫描方式为多反应离子监测（MRM），IS电压4 500 V，源温度500 ℃，雾化气温度50 ℃，气帘气241.32 kPa，辅助气344.74 kPa，碰撞气55.16 kPa。采集方式为正/负离子，其他质谱参数见表2。

1.4 试验方法

1.4.1 PGRs提取。

准确称取均质后的鲜枣样品10 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入20 mL含1%甲酸的乙腈溶液，高速匀浆 2 min，加入4 g无水硫酸镁和1 g无水乙酸钠，立即涡旋混合1 min，以10 000 r/min离心5 min，使乙腈和水相分层。

1.4.2 QuEChERS净化。

取4 mL上层乙腈溶液于QuEChERS离心管（含300 mg无水硫酸镁和100 mg C18）中，涡旋混合2 min，以10 000 r/min 离心5 min，移取全部上清液于15 mL玻璃管中，45 ℃水浴，氮气吹至近干，甲醇定容至1 mL，涡旋混匀1 min，上清液经0.22 μm有机相滤膜过滤，供高效液相色谱-串联质谱仪测定。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的选择

首先比较了ACQUITY HPLC BEH C18（1.7 μm，100 mm × 2.1 mm）、XSelect csh C18（2.5 μm，100 mm×2.1 mm）和ZORBAX Eclipse Plus C18（1.8 μm，3.0 mm×150 mm）3款色谱柱对5种PGRs的分离效果和色谱峰型的影响，结果表明，XSelect csh C18和ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱对萘乙酸的保留性能较差；而ACQUITY HPLC BEH C18色谱柱为三键键合式烷基柱，具有较宽的pH适应性，对离子化化合物具有较强的选择性，能较好地分离5种PGRs，且峰形尖锐，分析时间较短。因此，该研究选择ACQUITY HPLC BEH C18色谱柱为分离柱。

分别比较了水-乙腈、水-甲醇体系作为流动相时5种PGRs的分离效果，结果表明，以水-甲醇作为流动相时，5种化合物出峰时间较快且分离效果和峰型较差，而以水-乙腈作为流动相时，5种化合物的色谱峰分离度好，峰型对称。在流动相中加入一定量酸，可促进化合物电离，提高其离子化效率和灵敏度。当加入0.1%甲酸时，能有效抑制赤霉素、萘乙酸、2，4-D中羧酸官能团的电离，提高在流动相中的溶解度，故该试验选择0.1%甲酸水-乙腈为流动相。5种植物生长调节剂空白基质标准溶液的总离子流图如图1所示。