向日葵HaDGAT3基因的生物信息学和表达分析

摘要 利用生物信息学分析向日葵HaDGAT3编码蛋白，预测HaDGAT3编码蛋白是碱性和亲水性蛋白，二级结构以ａ螺旋为主（47.11%），亚细胞定位预测显示定位于细胞核。系统进化结果表明，HaDGAT3与小蓬草（Erigeron canadensis L.）DGAT3亲缘关系最近，序列相似性为68%。荧光定量PCR结果表明，HaDGAT3在向日葵各组织部位表达量表现为管状花>叶>种子，在茎、舌状花、根中未见表达。HaDGAT3在种子发育中后期（开花后22～37 d）表达量明显高于种子发育前期（开花后7～17 d），在开花后37 d最高。HaDGAT3基因表达量与种子油分和脂肪酸含量的相关性分析结果表明，HaDGAT3基因表达量与种子含油量呈显著正相关，推测HaDGAT3是与向日葵种子油分积累相关的重要基因。

关键词 向日葵；HaDGAT3；二酰甘油酰基转移酶；生物信息学；表达分析

中图分类号 S565.5  文献标识码 A   文章编号 0517-6611（2024）15-0107-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.15.023

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Bioinformatics and Expression Analysis of HaDGAT3 Gene in Sunflower

ZHOU Fei1，2

（1.Industrial Crops Institute，Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，Harbin，Heilongjiang 150086;2.Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences Postdoctoral Programme，Harbin，Heilongjiang 150086）

Abstract In this study，HaDGAT3 encoded protein in sunflower was analyzed by bioinformatics.It was predicted that the protein encoded by HaDGAT3 was basic and hydrophilic protein.The secondary structure of the protein encoded by HaDGAT3 was dominated by α-helix （47.11%），and the subcellular localization was predicted in the nucleus.Phylogenetic analysis showed that HaDGAT3 was closely related to Erigeron canadensis L.DGAT3，with sequence similarity of 68%.The results of real-time PCR showed that the expression level of HaDGAT3 in various parts of sunflower tissues was as follows：tubular flowers> leaves> seeds，but no expression was found in stems，ligulate flowers and roots.The expression level of HaDGAT3 was significantly higher in the middle and late stage （22-37 d after flowering） than in the early stage （7-17 d after flowering） of seed development，and the highest level was at 37 d after flowering.Correlation analysis of the expression level of HaDGAT3 gene with seed oil and fatty acid content showed that the expression level of HaDGAT3 gene was significantly positively correlated with seed oil content.It was speculated that HaDGAT3 gene was an important gene related to oil content accumulation in sunflower seeds.The results of this study provided theoretical basis for revealing the function of HaDGAT3 gene.

Key words Sunflower;HaDGAT3;Diacylglycerol acyltransferase;Bioinformatics;Expression anaylsis

植物油脂的合成与代谢是一个复杂的生物反应过程，参与其中的酶种类繁杂，功能多样。随着科技的发展，油脂合成过程中相关酶的编码基因逐渐被鉴定，如甘油-3-磷酸酰基转移酶（glycerol phosphate acyltransferase，GPAT）［1］、ω-3脂肪酸去饱和酶（ω-3 fatty acid desaturase，FAD）［2］等。其中，二酰甘油酰基转移酶（DGAT）催化二酰甘油加上脂肪酸酰基生成三酰甘油（TAG），是TAG合成途径的关键限速酶［3］。在油菜、大豆和玉米中已证明DGAT的过量表达能够提高油菜籽和玉米中的油脂含量［4］。迄今，共鉴定到4种亚型的DGAT，包括DGAT1、DGAT2、DGAT3及WS/DGAT。DGAT1、DGAT2在多数真核生物中普遍存在，是DGAT家族主要成员。相较于DGAT1和DGAT2，有关于DGAT3和WS/DAGT基因的研究报道较少。在花生发育种子中首先克隆AhDGAT3编码可溶性DGAT蛋白［5］，目前DGAT3仅在花生、拟南芥或特定酵母中研究的较多［6-7］。

向日葵（Helianthus annuus L.）是世界上主要的油料作物之一，葵花油不饱和脂肪酸含量极高，因此具有较高的营养价值。目前，已从向日葵基因组中鉴定出18个DGATs基因［8］，但关于DGAT3基因的功能还尚不清楚。笔者利用高油酸向日葵种子发育过程中RNA-seq的分析结果［9］，在甘油脂类代谢通路中鉴定出HaDGAT3基因，利用生物信息学分析HaDGAT3基因编码蛋白，并分析其在各组织部位的表达模式，为揭示HaDGAT3基因功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

国外引进的富含高油酸向日葵材料“L-1-OL-1”，种植于试验基地（哈尔滨市康金镇）。根据开花不同天数，从开花7～37 d，每5 d于同一时间段取葵花盘最外3圈籽粒，并取向日葵花期的叶、茎、根、管状花和舌状花，即刻放入液氮中，之后于超低温冰箱中保存。

1.2 方法

1.2.1 基因的生物信息学分析。

将HaDGAT3蛋白序列利用软件进行生物信息学分析（表1）。

1.2.2 荧光定量PCR分析。

利用天根植物总RNA提取试剂盒提取各组织部位RNA，使用东洋纺ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover试剂盒生成cDNA。荧光定量PCR使用东洋纺THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix试剂盒，以向日葵β-actin（AF282624）为内参基因，反应体系：模板1.2 μL，荧光染料10 μL，上、下游引物各0.6 μL，加水至20 μL。基因表达分析采用2-ΔΔCt法。内参引物为F：GCAAAAAGCAGCTCGTCTGT，R：AGCAGCTTCCATTCCAATCA，HaDGAT3引物为F：GAAAACCGTCCCAACATCAAC，R：TTCTTACCACAATCCGCCTC。

1.2.3 基因表达量与油脂含量的相关性分析。

利用SPSS statistics 17.0软件对种子发育不同时期基因表达量与5种基本脂肪酸含量、含油量进行pearson相关系数分析。

2 结果与分析

2.1 HaDGAT3生物信息学

2.1.1 HaDGAT3编码蛋白理化性质。

HaDGAT3基因开放阅读框序列长度为990 bp，编码329个氨基酸。HaDGAT3蛋白包含原子个数为4 982，化学式C1514H2514N430O495S29，相对分子质量（Mr） 35.59 kD，蛋白质等电点（pI）8.63，属于碱性蛋白，HaDGAT3编码蛋白由20种氨基酸组成（表2）。

2.1.2 HaDGAT3编码蛋白二级结构预测。HaDGAT3编码蛋白的二级结构包含α螺旋（47.12%），无规则卷曲（29.18%），延伸链（16.41%），β转角（7.29%），因此该蛋白二级结构以α螺旋为主（图1）。

2.1.3 HaDGAT3蛋白亲/疏水性和亚细胞定位预测。

HaDGAT3蛋白序列分析表明，亲水性大多为负数，因此推测HaDGAT3编码蛋白大概率为亲水性蛋白（图2）。预测该蛋白亚细胞定位在细胞核。

2.1.4 进化树构建与分析。

将HaDGAT3基因与芝麻（Sesamum indicum L.）、油棕（Elaeis guineensis Jacq.）等同结构域的DGAT3蛋白序列以及拟南芥（Arabidopsis thaliana L.）和甘蓝型油菜（Brassica napus L.）DGAT家族3个成员DGAT1、DGAT2、DGAT3构建进化树（图3），结果表明，HaDGAT3与这些物种的DGAT3聚在同一大分支上，其中与同属菊科的小蓬草（Erigeron canadensis L.）DGAT3亲缘关系最近，序列相似性为68%。

2.2 HaDGAT3基因表达分析

通过qRT-PCR发现，HaDGAT3在向日葵种子、叶、管状花中有不同程度的表达，在向日葵各组织部位表达量表现为管状花>叶>种子，在茎、舌状花、根中几乎没有表达。HaDGAT3在种子发育中后期（开花后22～37 d）表达量明显高于种子发育前期（开花后7～17 d），在开花后37 d最高（图4）。在向日葵种子发育不同时期，将HaDGAT3基因表达量与前期测定的种子油分和5种基本脂肪酸含量［10］进行相关性分析，结果发现HaDGAT3基因表达量与棕榈酸、硬酯酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、种子含油量的P值分别为-0.376、-0.311、0.508、-0.470、-0.342、0.769，且与种子含油量呈显著正相关（P<0.05）。

3 讨论

植物中油脂合成过程主要包括脂肪酸的从头合成、脂肪酸碳链脱饱和、脂肪酸碳链延长、TAG的生物合成，DGAT主要催化甘油二酯（DAG）形成TAG［11］，可以直接影响种子中脂肪酸的种类和含量。过表达DGAT1和DGAT2基因可促进种子油分积累。玉米中通过插入苯丙氨酸激活ZmDGAT1增加了玉米胚的含油量［12］。过表达麻疯树JcDGAT1和JcDGAT2基因可使油脂产量分别提高25.0%和29.6%［13］。

DGAT1和DGAT2的表达均能促进油菜种子含油量的积累，可调控DGAT1和DGAT2基因的表达来增加种子油含量［14］。DGAT3是一种植物胞质可溶性的金属酶，不包含跨膜结构与信号肽序列，与DGATl和DGAT2家族的序列同源性较低［15］。

植物DGAT3基因表达水平影响种子含油量和脂肪酸组成。

烟草中特异表达亚麻荠CaDGAT3-3基因可显著促进种子中不饱和脂肪酸的合成［16］。转AhDGAT3A和AhDGAT3B基因花生油酸含量提高了5.13%～21.26%，亚油酸含量降低了3.87%～31.18%，致使油酸/亚油酸比值提高5.01%～76.19%。这一结果可能归因于AhDGAT3对油酸脂肪酰底物具有偏好性选择，能够在种子油脂中积累更多的油酸［17］。陆地棉GhDGAT3基因的表达量与棉籽油积累量呈正相关［18］，这与该研究向日葵HaDGAT3基因表达量与种子含油量呈显著正相关的结果一致，推测向日葵DGAT3基因是与种子油分积累相关的重要基因。