OLR1基因生信分析及其在贵州黑山羊和黔北麻羊性腺轴中的表达
作者： 杨红 杨远青 周明帅 廖朝美 王正刚 袁超 杨洋
摘要 ［目的］研究OLR1基因与贵州黑山羊和黔北麻羊繁殖率之间的关系，为研究OLR1基因调控山羊卵泡发育的分子机制提供参考。［方法］通过生物信息学的手段对OLR1蛋白理化性质、亚细胞定位、信号肽位点、蛋白高级结构等进行预测，并通过对不同物种OLR1氨基酸序列进行同源性分析，构建系统发育进化树；采用RT-qPCR 的方法检测OLR1基因在单羔和多羔贵州黑山羊和黔北麻羊性腺轴各组织中的表达量。［结果］OLR1基因编码 275个氨基酸，理论pi值为6.37，OLR1是一种主要由α-螺旋卷曲构成的不具有信号肽的不稳定亲水性蛋白；与其他动物相比，山羊OLR1与反刍动物绵羊和牛的遗传距离最近。qPCR 结果显示：OLR1基因在贵州黑山羊及黔北麻羊下丘脑、输卵管、垂体、子宫和卵巢组织中均有表达。在单羔组贵州黑山羊下丘脑、子宫、卵巢、垂体中的表达量均极显著高于多羔组（P<0.01），在输卵管中的表达量高于多羔组，但二者间差异不显著（P>0.05）。在单羔组黔北麻羊下丘脑、垂体、卵巢中的表达量均极显著高于多羔组（P<0.01）；在输卵管中的表达量高于多羔组，在子宫中的表达量低于多羔组，但二者间差异不显著（P>0.05）。［结论］OLR1基因表达量与贵州黑山羊和黔北麻羊的繁殖性状呈负相关，可作为影响贵州本地山羊繁殖性能的重要候选基因。
关键词 贵州黑山羊；黔北麻羊；性腺轴；OLR1基因；生物信息学；繁殖性状
中图分类号 S 826 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2024）22-0088-05
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.22.017
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Bioinformatics Analysis of OLR1 Gene and Its Expression in Gonadal Axis of Guizhou Black Goat and Qianbei Ma Goat
YANG Hong1， YANG Yuan-qing1， ZHOU Ming-shuai2 et al
（1. Bijie Livestock Station， Bijie， Guizhou 551700;2. College of Animal Science， Guizhou University/Key Laboratory of Animal Genetics， Breeding and Reproduction of Plateau Mountainous Animals， Ministry of Education， Guiyang， Guizhou 550025）
Abstract ［Objective］To study the relationship between OLR1 gene and the reproductive rate of Guizhou black goat and Qianbei Ma goat， and to provide reference for studying the molecular mechanism of OLR1 gene regulating goat follicular development. ［Method］The physicochemical properties， subcellular localization， signal peptide sites， and advanced structure of OLR1 protein were predicted by bioinformatics methods. The phylogenetic tree was constructed by homology analysis of OLR1 amino acid sequences of different species. Then RT-qPCR was used to detect the expression of OLR1 gene in the tissues of the gonadal axis of single-lamb and multi-lamb Guizhou black goats and Qianbei Ma goats. ［Result］OLR1 gene encoded 275 amino acids， and the theoretical pi value was 6.37. OLR1 was an unstable hydrophilic protein without signal peptide， which was mainly composed of α-helix curl. Compared with other animals， goat OLR1 has the closest genetic distance to ruminant sheep and cattle. The results of qPCR showed that OLR1 gene was expressed in hypothalamus， oviduct， pituitary， uterus and ovary tissues of Guizhou black goat and Qianbei Ma goat. The expression in hypothalamus， uterus， ovary and pituitary of Guizhou black goat in single-lamb group was significantly higher than that in multi-lamb group （P<0.01）. The expression levels in hypothalamus， pituitary and ovary of Qianbei Ma goat in single lamb group were significantly higher than those in multiple lamb group （P<0.01）. ［Conclusion］The expression level of OLR1 gene was negatively correlated with the reproductive traits of Guizhou black goats and Qianbei Ma goats， which could be used as an important candidate gene affecting the reproductive performance of Guizhou local goats.
Key words Guizhou black goat;Qianbei Ma Goat;Gonadal axis;OLR1 gene;Bioinformatics;Reproductive traits
氧化型低密度脂蛋白受体1（OLR1）是一种凝集素清道夫受体，可识别多种配体，如氧化型低密度脂蛋白、多阴离子化学物质、阴离子磷脂等，具有结合、内化和降解低密度脂蛋白的作用［1-2］，主要分布于血管内皮细胞和肾、肺、神经元等血管丰富的组织中［1］。活性氧（ROS）可通过ox-LDL与OLR1的结合而上调，ROS引起氧化DNA损伤，生成体内氧化脂质和蛋白质［3］。因此，OLR1与胆固醇代谢［4］、动脉粥样硬化［5-6］，高血压［7］有关。在人类上，这些过程也伴随着癌症的发生，如在结肠癌中，OLR1敲低通过增加c-MYC下调SULT2B1来削弱糖酵解代谢，以抑制结肠癌细胞增殖及化学抗性；在胰腺癌中，OLR1通过增加c-myc表达和HMGA2的转录促进胰腺癌转移等。在动物上，这些过程能够优化胆固醇含量、游离脂肪酸摄入量和脂滴含量［8］，因此OLR1基因还与动物的乳脂率［9］、肉品质［10］和脂肪沉积［11］密切相关。此外，近年研究发现，OLR1也与动物的繁殖率相互关联，研究发现，OLR1基因突变位点中TT基因型个体的硒都黑猪总产仔数和产活仔数最高［12］，且OLR1基因中的p.K116Q SNP的母羊的窝产仔数、孪生率、繁殖力和产羔百分比低于CC基因型母羊［13］。以上均是OLR1基因与动物繁殖性状的关联性分析，但是，目前关于OLR1与山羊性腺轴中的表达及其与繁殖力之间的关系，只在贵州白山羊上有相关报道，而在贵州黑山羊和黔北麻羊上尚未被发现。因此，笔者以单羔、多羔贵州黑山羊和黔北麻羊为研究对象，对其性腺轴中OLR1的表达规律进行解析，以便为黔北麻羊和贵州黑山羊多胎品系的选育提供潜在的关键候选基因和分子标记物。此外，该试验还将进一步分析OLR1在山羊性腺轴中的表达与繁殖能力之间的关系，以探索其在山羊繁殖性能中的作用。
1 材料与方法
1.1 试验动物
贵州黑山羊和黔北麻羊分别由贵州省富兴畜牧业开发有限公司和贵州省农业科学院麦坪黑山羊养殖基地提供。按照体重相近的原则选择体况良好且健康无病的2～3岁单、多羔贵州黑山羊和黔北麻羊各3只，根据《动物屠宰条例》的要求屠宰后，采集山羊卵巢、子宫、下丘脑、输卵管和垂体组织，置于液氮中保存。
1.2 试剂及主要仪器
Trizol、氯仿、无水乙醇、SBYR Green RT-qPCR Mix、逆转录试剂盒、异丙醇等均购于贵州卓一生物科技有限公司；实时荧光定量PCR仪购自美国BIO-RAD有限公司；超微量紫外分光光度计购自美国赛默飞公司。
1.3 引物的设计与合成
根据NCBI上公布的山羊OLR1（XM_005680848）基因CDS编码区序列，使用Primer Premier 5.0引物设计软件设计OLR1基因RT-qPCR引物，内参基因β-acting引物序列参考［14］，引物序列见表1，由上海擎科生物科技有限公司合成。
1.4 RNA的提取及cDNA第一链的合成
使用Trizol法提取黔北麻羊和贵州黑山羊性腺轴组织RNA，将RNA浓度稀释至500 ng/μL后，逆转录获得cDNA，-80 ℃保存。
1.5 RT-qPCR检测OLR1基因在黔北麻羊和贵州黑山羊不同组织中的表达
采用RT-qPCR检测OLR1基因在单羔、多羔黔北麻羊和贵州黑山羊卵巢、下丘脑、垂体、子宫和输卵管组织中的表达。以相同浓度的cDNA为模板进行RT-qPCR反应，该试验反应终体系设定为10 μL：上、下游引物（100 μmol/L）各0.7 μL、cDNA模板1.2 μL、 qPCR mix 5.6 μL、ddH*O补至10 μL。根据RT-qPCR Mix说明书，设置反应条件，以β-acting作为内参基因，每组3次重复，进行RT-qPCR反应。
1.6 生物信息学分析
根据NCBI上公布的山羊OLR1蛋白氨基酸序列（XP_005680905.1），使用NetPhos 3.1（https：∥services.healthtech.dtu.dk/service.php？NetPhos-3.1）在线分析软件预测蛋白的磷酸化位点；Motif Search（https：∥www.genome.jp/tools/motif/）软件预测蛋白保守结构域；根据周志楠等［14］研究中所应用到的生物信息学分析方法，分别对OLR1蛋白氨基酸序列进行蛋白质理化性质、信号肽、蛋白质2级及3级结构等方面进行了预测，并将不同物种OLR1氨基酸序列进行同源性分析，在此基础上构建了系统发育进化树。
2 结果与分析