Box-Behnken响应面法优选低共熔溶剂提取巴西人参总皂苷工艺

摘要 ［目的］响应面法优选巴西人参总皂苷提取工艺，为其进一步开发利用提供参考。［方法］以苋科植物巴西人参为研究对象，采用超声辅助低共熔溶剂法提取总皂苷，通过单因素试验对尿素与氯化胆碱摩尔比、含水量、液料比、提取时间进行考察，以总皂苷得率作为评价指标，运用Box-Behnken响应面法对巴西人参总皂苷提取工艺进行优化。［结果］超声辅助低共熔溶剂提取巴西人参总皂苷的最佳工艺为尿素∶氯化胆碱=1∶1、含水量38%、液料比18∶1（mL∶g）、提取时间37 min，在此条件下，总皂苷得率为6.26%。［结论］该方法提取效率高、重复性好、操作简便，可用于巴西人参总皂苷的提取。

关键词 巴西人参；低共熔溶剂；总皂苷；提取工艺；响应面法

中图分类号 R 284  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2024）22-0162-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.23.034

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Optimization of Deep Eutectic Solvents Extraction of Total Saponins from Pfaffia glomerata by Box-Behnken Response Surface Methodology

DONG Ming-ran1， LIU Jia2， XIA Nian-tong2 et al

（1.Institute of Medicinal Plant Development/Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College， Beijing 100193;2. School of Pharmacy， Heilongjiang University of Chinese Medicine， Harbin， Heilongjiang 150040）

Abstract ［Objective］ Response surface methodology was used to optimize the extraction process of total saponins from Pfaffia glomerata， providing reference for its further development and utilization.［Method］Taking amaranthaceous plant Pfaffia glomerata as the research object， total saponins were extracted using ultrasound assisted deep eutectic solvent method. Through single factor experiments， the molar ratio of urea to choline chloride， water content， liquid-solid ratio and extraction time were investigated，the total saponin yield was used as the evaluation index， and the Box-Behnken response surface methodology was used to optimize the extraction process of total saponins from Pfaffia glomerata.［Result］ The optimal process for ultrasound-assisted deep eutectic solvents extraction of total saponins from Pfaffia glomerata was established with the following parameters： urea to choline chloride ratio of 1∶1， water content of 38%， liquid-material ratio of 18∶1 （mL∶g）， and extraction time of 37 minutes. Under the conditions， the total saponin yield achieved was 6.26%. ［Conclusion］This method has high extraction efficiency， good repeatability and simple operation， and can be used for the extraction of total saponins from Pfaffia glomerata.

Key words Pfaffia glomerata;Deep eutectic solvents;Total saponins;Extraction process;Response surface methodology

巴西人参［Pfaffia glomerata（Spreng.）Pedersen］，又称珐菲亚，苋科无柱苋属植物，以干燥根部入药，主要分布于南美洲热带雨林气候带，现在巴西、厄瓜多尔等地广泛种植，2001年后在中国境内成功引种^［1-2］。巴西人参是巴西戈伊亚斯地区常用的传统草药，巴西药典中记载其广泛应用于各种疾病，如壮阳、伤口愈合、降血糖、抗肿瘤等^［3］。现代研究表明巴西人参中主要含有三萜类及其皂苷^［4］、多糖类^［5］、甾酮及其苷类^［6］、黄酮及其苷类^［7］，还含有氨基酸、维生素等，其中皂苷类成分含量较高^［8］。

低共熔溶剂（deep eutectic solvents，DES）是一种由氢键结合形成的绿色环保、制备简单、可生物降解、可回收利用的新型溶剂，具有熔点低、毒性低、密度大、溶解性良好等特性^［9］，近年来受到广泛关注，可应用于环境保护、中药有效成分的提取^［10］、分离^［11］等方面，前景广阔。目前提取巴西人参皂苷类成分大多采用甲醇^［12］、乙醇^［13］等有机溶剂，而采用超声辅助DES法提取巴西人参中大量总皂苷鲜有研究。因此，该研究首先比较了不同的低共熔溶剂体系提取巴西人参总皂苷的能力，再通过单因素试验考察，设计响应面试验方案，对提取工艺进一步筛选优化，最终确定最优提取工艺，获得高含量高质量的巴西人参总皂苷提取物，为下一步药效物质基础研究以及巴西人参相关产品开发和资源利用提供一定的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试材。巴西人参购于宁波珐菲亚食品有限公司，经中国医学科学院药用植物研究所云南分所李海涛研究员鉴定为苋科植物巴西人参［Pfaffia glomerata （Spreng.） Pedersen］的干燥根，采用高速粉碎机进行粉碎，过3号标准筛（50目，孔径0.3 mm），得到巴西人参细粉，备用。

1.1.2 试剂。总皂苷检测试剂盒，购于南京集测生物科技有限公司；氯化胆碱（纯度≥98%）、尿素（纯度≥99%），均购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；高氯酸，购于天津市鑫源化工有限公司；冰醋酸，购于天津市永大化学试剂有限公司；甲醇，购于天津市北联精细化学品开发有限公司；所用试剂均为分析纯；水为纯化水。

1.1.3 仪器与设备。Cary 100型变温紫外分光光度计（安捷伦科技有限公司）；HH-S6A型电热恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司）；JNB-30002型电子天平（宁波群安实验仪器有限公司）；JHBE-50T型闪式提取器（上海钒帜精密仪器设备有限公司）；98-1-B型电子调温电热套（天津市泰斯特仪器有限公司）；KQ-500DE型超声波清洗器（昆山舒美超声仪器有限公司，功率600 W，频率40 kHz）。

1.2 试验方法

1.2.1 DES制备。DES制备采用加热搅拌法，氯化胆碱氢键受体（HBA）与尿素氢键供体（HBD）以一定的摩尔比混合，加热至80 ℃，连续搅拌，二者由固体熔融形成稳定、均一、透明的液体，再向体系中加入体积分数20%的蒸馏水，即得DES，室温下存储备用。溶液依次编号DES1～4，HBD与HBA的摩尔比见表1。

1.2.2 巴西人参总皂苷提取。

1.2.2.1

DES溶液提取。称取巴西人参细粉20 g，加入600 mL含水量30%的DES溶液，30 ℃超声提取40 min，8层纱布过滤后，保存备用。

1.2.2.2 对照提取试验。以体积分数70%的乙醇为溶剂进行对照提取试验。

热回流：称取巴西人参细粉20 g，加入400 mL 70%乙醇，加热回流提取1 h，8层纱布过滤，收集滤液；向滤渣中加入200 mL 70%乙醇，继续加热回流提取1 h，8层纱布过滤，合并2次滤液，保存备用。

闪式提取：称取巴西人参细粉20 g，加入400 mL 70%乙醇，闪式提取6 000 r/min，提取45 s，8层纱布过滤，收集滤液，保存备用。

超声提取：称取巴西人参细粉20 g，加入400 mL 70%乙醇，超声提取40 min，8层纱布过滤，收集滤液，保存备用。

1.2.3

总皂苷含量测定。根据试剂盒说明，配制浓度为1 mg/mL 的人参皂苷Re标准品母液。分别移取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL人参皂苷Re标准品母液置于6个1 mL容量瓶中，加入甲醇定容，混匀，得到不同浓度梯度的人参皂苷Re标准品溶液。分别移取0.2 mL不同浓度标准品溶液、0.2 mL 检测试剂、0.8 mL高氯酸置于5 mL离心管中，55 ℃水浴20 min。精密移取反应液200 μL置于5 mL离心管中，加入1 mL冰醋酸，充分混匀，589 nm下测定吸光度。以吸光度为纵坐标（y）、总皂苷质量浓度为横坐标（x）进行线性回归，得到回归方程为y=0.680 5x-0.005 3（R2=0.998 2）。

精密移取0.2 mL提取液、0.2 mL检测试剂、0.8 mL高氯酸置于5 mL离心管中，55 ℃水浴20 min。精密移取反应液200 μL置于5 mL离心管中，加入1 mL冰醋酸，充分混匀，589 nm下测定吸光度。总皂苷得率计算方法如下：

总皂苷得率=ρ×V×nm×100%

式中：ρ为测定的巴西人参总皂苷质量浓度（mg/mL）；V为提取液体积（mL）；n为稀释倍数；m为巴西人参细粉质量（g）。

1.2.4 单因素试验。按照“1.2.2”项下巴西人参总皂苷提取工艺，以总皂苷得率为评价指标，分别以不同尿素与氯化胆碱摩尔比（1∶2、1∶1、2∶1、4∶1）、含水量（10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%）、液料比［10∶1、20∶1、30∶1、40∶1（mL∶g）］、提取时间（20、30、40、50、60 min）进行单因素试验，以此确定各因素的最适条件和优化范围。

1.2.5

响应面试验。基于单因素试验结果，以含水量、液料比、提取时间为自变量，总皂苷得率（Y）为响应值，采用Design-Expert 8软件进行响应面试验，利用GraphPad Prism 9.5软件进行数据分析。