气相色谱-质谱法测定食用植物油中多种植物甾醇含量

摘要 ［目的］建立气相色谱-质谱法（GC-MS）同时测定食用油中β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇含量的方法。［方法］样品选用氢氧化钾-乙醇皂化、正己烷萃取、浓缩、衍生化后以正己烷定容，采用GC-MS选择离子扫描模式（SIM），外标法定量。［结果］β-谷甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇的线性范围为5～500 μg/mL，菜油甾醇的线性范围为2.5～250.0 μg/mL，线性相关系数（R2）均大于0.999，检出限为0.05～0.10 mg/kg，定量限为0.1～0.3 mg/kg，加标回收率为80.5%～107.8%，相对标准偏差（RSD）为2.3%～9.8%。［结论］该方法操作简单、高效、灵敏度高、重复性好，适用于食用植物油样品中β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇含量的测定。

关键词 气相色谱-质谱法；食用植物油；植物甾醇；含量测定

中图分类号 TS 227  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2024）22-0174-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.22.037

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Determination of Various Phytosterols in Edible Vegetable Oils by Gas Chromatography-mass Spectrometry

HUANG He-he

（Fujian Inspection and Research Institute for Product Quality，Fuzhou，Fujian 350002）

Abstract ［Objective］A method for simultaneous determination of β-sitosterol，stigmasterol，campesterol and brassicasterol in edible oil was established by gas chromatography-mass （GC-MS）.［Method］Sample was saponified by potassium hydroxide-ethanol solution，n-hexane extraction，concentration，derivatization，and then diluted with n-hexane.GC-MS was used to select ion scanning mode （SIM） and external standard method was used for quantification.［Result］ There were good linear relationships for β-sitosterol，stigmasterol，brassicasterol in 5-500 μg/mL，and campesterol in 2.5-250.0 μg/mL，respectively.Linear correlation coefficients（R2）were greater than 0.999.Limits of detection were 0.05-0.10 mg/kg and limits of quantification were 0.1-0.3 mg/kg，respectively.Adding standard recovery rate was 80.5%-107.8%，relative standard deviation （RSD） was 2.3%-9.8%.［Conclusion］This method is easy to operate，efficient，highly sensitive，and has good repeatability，which is suitable for the determination of β-sitosterol，stigmasterol，campesterol and brassicasterol contents in edible vegetable oil samples.

Key words Gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）;Edible vegetable oil;Phytosterol;Content determination

植物甾醇，又被称为植物固醇，在各类植物中普遍存在，现已被广泛应用在食品、药品领域。植物甾醇在结构、生化特性上均与胆固醇相似，但又略有不同^［1-2］。研究发现，植物甾醇能够降低人体血清胆固醇（TC）与低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平，可以有效防治心血管疾病并加速胆固醇的代谢降解。人体并不能自主合成植物甾醇，但在植物源品中植物甾醇是生物活性成分，人体可从日常饮食中获得所需的植物甾醇。根据中华人民共和国卫生部公告2010年第3号规定，在除婴幼儿食品外，其他各类食品均可以使用植物甾醇，且食用量≤2.4 g/d^［3］；《中国居民膳食营养素参考摄入量》中推荐植物甾醇摄入量在0.9 g/d^［4］。

食用植物油作为人们日常的食用食品，其中含有丰富的植物甾醇、矿物质、不饱和脂肪酸等，同时也是植物甾醇含量较为丰富的食品之一。因此，在日常饮食中，可以通过控制食用油中植物甾醇的含量，来控制所需人群每日植物甾醇的摄入量，从而指导人们合理膳食。目前，常见的植物甾醇分析方法主要有薄层色谱法（TLC）、气相色谱法（GC）、气相色谱-质谱法（GC-MS）、气相色谱-三重四极杆质谱法（GC-MS/MS）、液相色谱法（LC）、液相色谱-三重四极杆质谱法 （LC-MS/MS）等^［5-17］。其中TLC前处理繁杂，操作性不强；GC测定植物甾醇的灵敏度低、重现性差；LC存在干扰大、响应差等；GC-MS/MS和LC-MS/MS虽然具有干扰小、重现性好、灵敏度高等特点，但仪器价格高，不利于方法的推广。常见食用植物油中的植物甾醇主要为β-谷甾醇、菜油甾醇、谷甾醇和菜籽甾醇4种，占总甾醇的50%～90%。笔者结合当前的研究，选用GC-MS，通过优化相关参数，建立便捷、高效、灵敏的分析方法，为有效测定食用油中4种常见植物甾醇的含量提供技术支持，也为指导人们合理膳食提供保障。

1 材料与方法

1.1 仪器 7890N/5977气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent科技有限公司）；毛细管色谱柱（HP-5MS，30 m×250 μm×0.25 μm，美国Agilent科技有限公司）；分析天平BT224S；WA12通用水浴槽（德国维根技术有限公司）；MS3 basic 旋涡混匀器（德国艾卡集团）；EVA50氮吹仪（北京POLYTECH仪器有限公司）；Heraeus Multifuge X3R离心机（美国Thermo Fisher科技有限公司）。

1.2 试剂 β-谷甾醇、豆甾醇购于上海安谱（ANPEL）实验科技有限公司；菜籽甾醇、菜油甾醇购于美国Standford Chemicals 公司；N，O-双（三甲基硅）三氟乙酰胺（BSTFA）-三甲基氯硅烷（TMCS）（V∶V=99∶1）；无水乙醇、异辛烷、丙酮、氢氧化钾、无水硫酸钠均为分析纯。4种植物甾醇标准品信息见表1。

1.3 色谱质谱条件

1.3.1 色谱条件。毛细管色谱柱为HP-5MS弹性石英毛细管色谱柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；进样量1 μL；进样口温度320 ℃；分流模式为分流进样；分流比为5∶1；载气为高纯度氦气（纯度≥99.999%）；载气流速1 mL/min；GC与MS接口温度300 ℃。升温程序：起始温度150 ℃，保持2 min；以15 ℃/min 升温至300 ℃，保持8 min；以10  ℃/min，升温至320 ℃，保持8 min。

1.3.2 质谱条件。EI离子源温度230 ℃; 能量70 eV；四极杆温度150 ℃；传输线温度290 ℃；溶剂延迟时间12 min；Scan扫描范围为40～450 amu；扫描模式为SIM模式分段扫描。

1.4 标准溶液的配制

分别称取10 mg（精确至0.01 mg）β-谷甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇，加入少量异辛烷与丙酮溶剂溶解，配制成浓度为1 mg/mL的植物甾醇标准储备溶液，密封保存。标准溶液系列工作液以正己烷为稀释溶剂，现配现用。

1.5 样品的前处理

准确称取各类食用油样品0.1 g（精确至0.000 1 g）至10 mL试管中，加入2 mol/L氢氧化钾-乙醇溶液5 mL，涡旋1 min，置60 ℃水浴锅中水浴加热45 min，取出，冷却至室温。加入2～3 mL蒸馏水，再准确移取2 mL正己烷，涡旋1 min，静置待分层，取上层有机溶液，重复提取2次，合并有机相，用去离子水洗涤至中性，过无水硫酸钠进行脱水，经氮吹仪浓缩近干后，加入100 μL BSTFA- TMCS（V∶V=99∶1）80 ℃衍生化20 min，正己烷定容至1 mL，涡旋混匀后，过0.22 μm有机滤膜上机测定。

2 结果与分析

2.1 试验条件的优化

2.1.1 质谱条件的优化。

采用GC-MS对4种植物甾醇进行全扫描，然后，根据质谱图分别对4种植物甾醇各个化合物的碎片离子进行选择，以相对丰度较高、质量数较大的离子碎片作为待测物的特征目标监测离子。选定监测离子后，采用SIM模式（选择离子扫描）对目标化合物进行定性定量分析，以提高灵敏度、减少干扰。4种植物甾醇的保留时间及定性、定量离子见表2。

2.1.2 色谱条件的优化。

4种待分析的目标物均为弱极性化合物，根据相似相溶的原理，可选择弱极性色谱柱作为分离柱，同时结合当前相关研究，该研究选用5%苯基-甲基聚硅氧烷作为固定相的毛细管色谱柱，对4种目标物进行检测分析。同时，通过优化合理的升温程序，以达到将化合物分离的目的。通过试验表明，HP-5MS弹性石英毛细管色谱柱（30 m×250 μm×0.25 μm）在优化的条件下，菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇具有良好的响应和分离度。4种植物甾醇总离子流图见图1，4种植物甾醇特征目标监测离子质谱图如图2所示。

2.1.3 皂化条件的优化。

植物甾醇沸点高，较难气化，采用气相色谱-质谱联用法检测，需要结合皂化、衍生前处理技术。植物甾醇进行皂化反应，通常选用氢氧化钾-甲醇或氢氧化钾-乙醇，该研究比较了氢氧化钾-甲醇与氢氧化钾-乙醇分别作为植物甾醇进行皂化的出峰情况。结果表明，采用氢氧化钾-甲醇进行皂化时，存在较多的杂质，对试验造成干扰；采用氢氧化钾-乙醇进行皂化时，峰形匀称，且具有良好的分离度与灵敏度。

该研究在选用氢氧化钾-乙醇后，比较了不同温度与时间下的皂化效果。分别将皂化温度设置为室温、40 ℃、60 ℃和80  ℃，在不同温度下分别进行15、30、45、60 min反应时间的比较，通过分析16个组别的结果情况，结果表明食用植物油样品在4个不同温度下反应45 min，在室温和40 ℃条件下，油脂溶解性较差，对目标化合物产生较大干扰，在60、80 ℃条件下进行衍生，脂肪在热乙醇中具有较好的溶解性，能够有效地降低对目标化合物的干扰。结合除杂效果及节能减排，该研究最终选择60 ℃作为衍生温度。通过对不同皂化温度及反应时间的对比，该研究最终选择采用氢氧化钾-乙醇作为皂化试剂，皂化时间为45 min，反应温度为60 ℃。

2.2 方法学验证

2.2.1 线性范围与检出限、定量限。

取4种植物甾醇系列混合标准溶液按照该研究优化的仪器条件进行测定分析。横坐标为目标物各组分浓度，纵坐标为目标物各组分的峰面积，绘制标准曲线，得出线性方程。结果表明（表3），4种植物甾醇在线性范围内呈较好的线性关系，相关系数（R2）均大于0.999。根据国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC）的规定，检出限S/N（信噪比）≥3，定量限S/N≥10。4种目标化合物的检出限为0.05～0.10 mg/kg，定量限为0.1～0.3 mg/kg。