黑曲霉和酒糟二次发酵提升低次烟叶品质的研究

摘要 为探究黑曲霉及酒糟二次发酵对低次烟叶提质效果，对低次烟叶发酵后分析处理前后烟叶常规化学成分和致香成分的变化以及烟叶感官评吸品质的改善情况。结果表明，通过黑曲霉预发酵后的烟叶较发酵前总氮含量由8.87%降至2.31%、总植物碱含量由8.71%降至3.19%、水溶性糖含量由19.21%升至20.80%、还原糖含量由16.68%升至18.70%，除钾、氯外其他常规化学成分含量变化显著。虽然通过黑曲霉和酒糟二次发酵后烟叶各常规化学成分含量与黑曲霉预发酵过的烟叶相比变化不显著，通过二次发酵处理的烟叶致香物质总含量为787.639 μg/g，与仅经过黑曲霉处理的烟叶（745.449 μg/g）相比大幅度提高。由此可见，黑曲霉及酒糟二次发酵对低档次烟叶有较好的提质效果。该研究结果可为库存低次烟叶的提质提供新思路。

关键词 微生物发酵；低次烟叶；烟叶提质；酒糟；黑曲霉

中图分类号 Q 815  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2023）16-0178-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.16.042

Study on the Quality Improvement of Low-grade Tobacco Leaves by the Secondary Fermentation of Aspergillus niger and Vinasse

SHAO Deng-yin1， LI Yu-rui2， ZOU En-kai1 et al

（1.Technology Center， China Tobacco Jiangxi Industrial Co.， Ltd.， Nanchang，Jiangxi 330096;2. College of Tobacco Science， Yunnan Agricultural University， Kunming， Yunnan 650201）

Abstract In order to explore the improvement effect of secondary fermentation of Aspergillus niger and vinasse on the quality of low-grade tobacco leaves， the low-grade tobacco leaves were fermented，the changes of conventional chemical components and aroma components of tobacco leaves before and after fermentation， and the improvement of sensory evaluation quality of tobacco leaves were analyzed. The results showed that the total nitrogen content in the tobacco leaves after pre-fermentation by A. niger decreased from 8.87% to 2.31%， the total alkaloid content decreased from 8.71% to 3.19%， the water-soluble sugar content increased from 19.21% to 20.80%， and the reducing sugar content increased from 16.68% to 18.70% compared with that before the pre-fermentation. The contents of conventional chemical components except potassium and chlorine changed significantly. Although the content of conventional chemical components in the tobacco leaves after the secondary fermentation of A. niger and vinasse did not change significantly compared with the tobacco leaves after the pre-fermentation by A. niger， the total content of aroma substances in the tobacco leaves treated by the secondary fermentation was 787.639 μg/g， which was greatly increased than that in the tobacco leaves treated by A. niger （745.449 μg/g）. Therefore， the secondary fermentation of A. niger and vinasse had a better effect on improving the quality of low-grade tobacco leaves. The results of this study could provide new ideas for improving the quality of low-grade tobacco in stock.

Key words Microbial fermentation;Low-grade tobacco leaves;Quality improvement of tobacco leaves;Vinasse;Aspergillus niger

基金项目 江西中烟工业有限责任公司科技项目（赣烟工科计2021-08）。

作者简介 邵灯寅（1990—），男，江西乐平人，工程师，硕士，从事卷烟调香研究。

通信作者，高级工程师，硕士，从事卷烟调香研究。

收稿日期 2022-08-15

近年来，工业中低次烟叶库存逐年增加，这极大地阻碍了卷烟行业的发展，有效提升工业库存低次烟叶的品质已经成为烟草行业的一个研究重点。目前，微生物发酵法因具有不受气候条件限制、生产周期短、对环境友好等［1］优点而在我国烟草生产过程中广泛应用。低次烟叶具有刺激性大，伴有较强的生烟感和生青杂气等特点［2］。全铭沁等［3］研究表明黑曲霉发酵液更适合用于降低烟叶的刺激性。许春平等［4］的研究也证实再造烟叶经过黑曲霉降解后烟叶的刺激性明显减轻。黑曲霉（Aspergillus niger）在烟叶发酵中主要用于降低烟叶中淀粉与蛋白质、果胶以及纤维素的含量［5］，使之进一步转化分解为葡萄糖等物质，从而降低烟叶的刺激性［6］。

黑曲霉虽然对烟叶的刺激性有较好的改善效果，但黑曲霉无法有效改善低次烟叶中的生青杂气［3］，且被其处理后的烟叶劲头明显不足。研究发现，用酒糟发酵食醋时会产生甘油、脂肪酸等香味物质［7］，同时酒糟还能为多种有利于烟叶醇化的微生物提供优质氮源、碳源［8］，其在发酵过程中还能提高一些蛋白酶的活性［9］。酒糟中含有丰富的矿物质以及钙、铁等微量元素，还含有多种菌体自溶产生的各种生物活性物质（如类脂化合物、酶等）［10］。以上这些特性理论上能够很好地弥补黑曲霉发酵烟叶时的不足，但目前我国对酒糟发酵提质的研究主要集中在牲畜饲料的提质方面，而用于烟叶提质方面的研究较少。为了探究黑曲霉和酒糟二次发酵对低次烟叶的提质效果，笔者利用黑曲霉和自酿米酒酒糟对烟叶进行二次发酵处理，以期为减轻低次烟叶的库存压力提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 烟叶原料。库存低档次上部烟叶，产地为云南大理剑川，由江西中烟技术中心提供。

1.1.2 发酵微生物制剂。黑曲霉，实验室保存；米酒酒糟，自制。

1.1.3 烟叶液体培养基。将烟叶剪成碎片后用无菌水37 ℃下浸泡12 h，在100 mL培养基中加入0.5 g烟叶碎片，置于115 ℃压力蒸汽灭菌器中灭菌20 min，制成液体培养基，用于培养黑曲霉。

1.2 主要仪器与设备

低温离心机，为深圳瑞沃德生命科技有限公司产品；连续流动分析仪，为德国布朗卢比公司产品；气相色谱-质谱联用仪，为美国安捷伦公司产品；同时蒸馏萃取装置，为郑州科技玻璃仪器厂产品；旋转蒸发仪为上海亚荣生化仪器厂产品；恒温恒湿箱，为德国宾德公司产品；QS-Ⅱ试样切丝机，为郑州天宏自动化技术有限公司产品；加料泵；填烟器为德国GIZEH金字塔填烟器；立体压力蒸汽灭菌器，为上海申安医疗器械厂产品。

1.3 方法

1.3.1 样品处理。①黑曲霉菌悬液的制备。挑选黑曲霉单菌落接种至10 mL烟叶液体培养基中，培养至OD600为0.6～0.8（即对数期），离心（4 ℃，4 500 r/min）后将菌体重悬在1 mL 10%葡萄糖溶液（无菌水配制），得到菌悬液。②黑曲霉预处理烟叶的方法。称取含水率12%的烟叶碎片30 g，喷施6 mL制备好的黑曲霉菌悬液，对照样品喷施等量无菌水。将处理后的样品烟叶和对照烟叶装入无菌食品袋中，于温度28 ℃、湿度60%恒温恒湿培养箱中发酵12 h。③自酿米酒酒糟发酵处理烟叶的方法。将烟叶碎片平铺开（尽量不要重叠）并把酒糟涂抹在烟叶碎片上，盖上4层纱布，置于28 ℃培养箱中培养5 d。

1.3.2 试验方法。将各处理的烟叶切丝并取适量烟丝进行化学成分和致香成分分析，剩余部分烟丝制成卷烟，用于后续的感官评价。对比各处理前后的烟叶常规化学成分、致香成分和感官质量的变化，确定通过提质处理后烟叶总体品质的提升效果。试验处理设计见表1。

1.3.2.1 常规化学成分测定。参考YC/T 161—2002 《烟草及烟草制品 总氮的测定 连续流动法》、YC/T 160—2002 《烟草及烟草制品 总植物碱的测定 连续流动法》、YC/T 159—2002 《烟草及烟草制品 水溶性糖的测定 连续流动法》、YC/T 217—2007 《烟草及烟草制品 钾的测定 连续流动法》、YC/T 162—2002 《烟草及烟草制品 氯的测定 连续流动法》对烟丝中常规化学成分（总氮、总植物碱、水溶性糖、还原糖、钾、氯）进行测定。

1.3.2.2 致香物质的测定及分类。致香物质的样品处理方法与GC/MS分析条件参照文献［11］的方法，以萘作为内标化合物。致香物质的分类方法参考文献［12］。

1.3.2.3 样品评价。由专业评吸人员在同一时间分别对单料烟进行评吸，每次抽吸3支卷烟，对每个处理的单料烟进行3次评吸。以T1为对照（CK），对T2、T3处理香气质、量的变化以及口感的改善等方面进行评价。

1.3.3 数据处理。数据处理中采用LSD法进行多重比较；利用Microsoft Excel 2019和IBM SPSS Statistics 26软件进行数据统计与分析；使用OriginPro 2021软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 常规化学成分分析

烟叶的香气主要反映烟叶的内在品质，烟叶的常规化学成分影响烟气成分的释放效果以及烟草的吃味［13-14］。由表2可知，T2、T3处理总氮、总植物碱、水溶性糖的含量与T1处理存在显著差异，而T2、T3处理间差异不显著。T1、T2、T3处理钾和氯的含量变化不大；T2、T3处理烟叶的总氮、总植物碱含量较T1处理明显下降，T2、T3处理水溶性糖、还原糖的含量较T1处理有所上升；T3处理总氮、总植物碱和还原糖的含量较T2处理略有下降，T3处理水溶性糖的含量较T2处理略有提升。