中药草本液的体外抗菌性能检测

摘要 ［目的］研究含龙井提取物和薄荷脑等成分的中药草本液的体外抗菌性能及抗菌机理。［方法］选用大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和白色念珠菌（Candida albicans）检测草本液的最小抑菌浓度（MIC）、最低杀菌浓度（MBC）、抑菌环，利用Live-Dead试剂盒染色确定草本液抗菌活性，在扫描电子显微镜下观察草本液作用后细菌表面微观结构变化并分析作用机理。［结果］MIC和MBC结果表明草本液在稀释2倍之后对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌仍具有抑制作用和杀菌作用；抑菌率、抑菌环与Live-Dead荧光染色表明草本液有显著抗菌作用；草本液作用后的细菌表面结构发生明显变化。［结论］草本液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌具有显著的抗菌效果。

关键词 中药草本液；金黄色葡萄球菌；大肠杆菌；白色念珠菌；抗菌活性；抗菌机理

中图分类号 R285 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2023）17-0144-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.17.032

Antibacterial Performance Test of Herbal Liquid of Chinese Medicine in vitro

ZHANG Huan-shuo1， ZHANG Rui1， ZHAO Xing-gang2，3 et al

（1. Research Center for Nano-Biomaterials，Analytical ＆ Testing Center，Sichuan University，Chengdu，Sichuan 610065;2. Shenzhen Weiduo Technology Co.， Ltd.， Shenzhen， Guangdong 518000;3.Guangxi Weiduo Technology Co.， Ltd.， Fangchenggang，Guangxi 518000 ）

Abstract ［Objective］To study the antibacterial effect and antibacterial mechanism of a traditional Chinese medicine herbal liquid that contains Longjing extract and menthol in vitro. ［Method］ E. coli， S. aureus and C. albicans were selected to determine the antibacterial rate and antibacterial activity by detecting minimum inhibitory concentration （MIC）， minimum bactericidal concentration （MBC）， antibacterial ring diameter and Live-Dead fluorescence staining. The effect of traditional Chinese medicine herbal liquid on the surface structure was observed by scanning electron microscope （SEM） and analyzed its antibacterial mechanism. ［Result］ The result of MIC and MBC showed that the herbal liquid diluted two times had inhibitory and bactericidal effects on E. coli， S. aureus and C. albicans. Antibacterial rate， antibacterial ring and Live-Dead fluorescence staining revealed that the herb liquid had significant antibacterial effect. The surface structure of bacteria changed obviously. ［Conclusion］The herb liquid has significant antibacterial effect on E. coli， S. aureus and C. albicans.

Key words Herbal liquid of Chinese medicine;Staphylococcus aureus;Escherichia coli;Candida albicans;Antibacterial activity;Antibacterial mechanism

西湖龙井草本液是以龙井提取物、薄荷脑为主要抗菌成分的中药草本液产品，其主要功能为抗菌消炎、清热解毒、利咽润喉，主要使用方式为雾化吸入。中药结合雾化技术区别于传统的闻香吸入和烟熏吸入，形成了新型给药模式，有着雾化颗粒小、易吸收、药物利用率高的特点，可以针对治疗呼吸系统炎症［1］。

龙井提取物含有的茶多酚和薄荷醇2种中药材料提取物均具有广谱抗菌性能，将茶多酚与薄荷醇联合使用的抗菌机理的研究鲜见报道。为验证本草本液疗效，开展对草本液的体外抗菌活性和抗菌机理的研究。该研究选取了革兰氏阴性菌大肠杆菌（Escherichia coli）、革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和真菌白色念珠菌（Candida albicans）3种菌，这3种菌均为人类活动中易接触的致病菌种。大肠杆菌易导致肠道外感染，如化脓性感染或者泌尿道感染；金黄色葡萄球菌易导致化脓性感染，如毛囊炎、伤口化脓等；白色念球菌可以造成皮肤、黏膜、内脏和中枢神经系统的急、慢性感染［2］。该研究通过测定草本液对这3种菌的最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration、MIC）、最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）来研究其抗菌效果，利用抑菌环试验、Live-Dead 荧光染色以及扫描电子显微镜试验考察草本液对3种菌的抗菌活性以及细菌表面微观结构在草本液作用前后的变化，研究天然植物中药提取物的抗菌机理。

1 材料与方法

1.1 试剂

西湖龙井草本液（深圳蔚多科技有限公司）；金黄色葡萄球菌（CMCC26003）、大肠杆菌（CMCC（B）44102）、白色念球菌［CMCC（F）98001］均购自上海保藏生物技术中心；营养琼脂（北京奥博星生物技术有限公司）；磷酸盐缓冲液药片（phosphate buffer solution，PBS，赛默飞世尔科技有限公司）；生理盐水（山东科伦药业有限公司）；无水乙醇（成都市科隆化学品有限公司）；扫描电镜专用固定液（北京索莱宝科技有限公司）；胰蛋白胨（上海阿拉丁试剂有限公司）；Live-Dead试剂盒（赛默飞世尔科技有限公司）；青霉素钠（山东圣旺药业股份有限公司）；冰乙酸（上海阿拉丁试剂有限公司）。

1.2 仪器

扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM，型号HITACH S530，日本电子株式会社）；无菌工作台（型号SW-CJ-2FD，苏州净化设备有限公司）；立式蒸汽灭菌锅（型号YXQ-LB-50SII，上海博迅实业有限公司）；恒温培养箱（型号SPX-160B-2，上海福玛实验设备有限公司）；精密电子天平（型号BT-25S，德国Sartorius AG 集团）；荧光倒置显微镜（型号Eclipse TI-U，日本Nikon公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 细菌培养。

称取3 g胰蛋白胨于试剂瓶中，加入100 mL蒸馏水，超声分散至溶解，得液体培养基，立式蒸汽灭菌锅灭菌（表压1.7 kg/cm2，121 ℃，30 min），冷却备用。取营养琼脂33 g，加入1 000 mL蒸馏水中，超声分散溶解，立式蒸汽灭菌锅灭菌，倒入培养皿，放凉后得固体培养基备用。取少量甘油封存的细菌接种于液体培养基中37 ℃恒温培养24 h后备用［3］。

1.3.2 抑菌率测定。

分别将100 μL菌液（1×104～9×104 CFU/mL）加入4管5 mL草本原液（试验组）或4管5 mL生理盐水（对照组），混合均匀，分别作用2、5、10、20 min后，各取0.5 mL加入含5 mL PBS 的试管内，充分混匀后，PBS稀释102、103倍后接种于固体培养基，37 ℃培养48 h，进行活菌菌落计数。试验重复3次，按下式计算抑菌率：

α=[（β-γ）/β]×100%

式中：α为抑菌率（%）；β为生理盐水对照组平均菌落数（CFU）；γ为草本原液试验组平均菌落数（CFU）。

1.3.3 抑菌环测定。

移取100 μL菌液（1×106～1×108 CFU/mL）与10 mL未凝固的固体培养基混合，倒入培养皿，分别取草本原液（试验组）、丙三醇（对照组）滴加于空白纸片5 mm圆形滤纸片若干，并置于混合细菌的固体培养基上，放37 ℃恒温培养箱24 h，拍照并计算抑菌圈直径，试验重复3次［4］。

1.3.4 MIC和MBC测定。

在96孔板中，每孔加入100 μL液体培养基，一列共12孔。利用对倍稀释法，在第1孔处加入100 μL草本原液后混匀，然后从第1孔用移液枪吸取100 μL混合液（草本原液浓度50%）加至第2孔后混匀，再在第2孔吸取100 μL（草本原液浓度25%）加至第3孔，混匀。如此重复稀释至第11孔，在第11孔吸取100 μL弃去，第12孔为不含样本的对照。向每孔加入100 μL菌液（0.5×106～0.5×108 CFU/mL）。将96孔板置于37 ℃培养箱中培养24 h。以肉眼观察，药物浓度最低且培养基不出现浑浊，无细菌生长孔即是该菌的MIC。确认MIC后，用接种环分别蘸取包括MIC浓度孔的左右共5孔的样本并接种于固体培养基，将培养基置于37 ℃培养箱中培养24 h，用活菌计数法检查菌落数，平均数小于5个的最小稀释浓度即为该菌的MBC［5］。试验均重复3次以上。

1.3.5 Live-Dead染色。

在2个96孔板中将100 μL菌液分别加入100 μL草本原液（试验组）、100 μL丙三醇（阴性对照组）、100 μL冰乙酸［6］（白色念珠菌阳性对照组）、100 μL青霉素钠（0.192 mg/mL，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌阳性对照组），最终菌液浓度为5× 105～5 × 107 CFU/mL。将96孔板置于37 ℃培养箱中分别培养2和5 min。避光条件下，分别将等量 Live-Dead 试剂A液和B液混合得到Live-Dead染色剂。将染色剂加入96孔板中，混匀后孵育20 min，使用荧光倒置显微镜观察并拍照。

1.3.6 SEM观察。

在24孔板中放入无菌圆形玻片，移取100 μL菌液（1×106～1×108 CFU/mL）与100 μL草本原液样本于24孔板中，培养24 h后吸出样本菌液混合液体后，将玻片用PBS清洗1次，然后使用扫描电镜专用固定液固定1.5 h，再用梯度乙醇溶液（30%、40％、50％、60％、70％、80％、90%、95%、100%）进行脱水（其中100%乙醇脱水3次），每个梯度脱水10 min，真空干燥12 h，样品表面喷金，使用SEM观察样品表面细菌表面结构［7］。

1.4 统计学方法

采用Excel 软件的T.TEST函数进行数据分析，组间比较采用独立样本t检验；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 抑菌率

草本液原液对白色念珠菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌悬液（1×104～9×104 CFU/mL）不同作用时间下抑菌率如表1所示，37 ℃恒温培养48 h后，根据固体培养基上的菌落数计算出草本原液对3种菌的抑菌率，草本原液对3种菌有较强的抑制作用且原液在与菌液接触的2 min内就表现出明显的抑菌作用，不同作用时间草本液的抑菌率均大于99.9%。