云南省部分地区猪感染BVDV流行病学调查

摘要 为了解云南省部分地区猪感染牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的情况，对来自散养户和规模猪场的211份不同年龄段粪便样品进行RT-PCR分子生物学鉴定。结果显示，散养户和规模猪场的BVDV阳性率分别为16.67%和5.83%，哺乳仔猪、断奶仔猪、育肥猪和种母猪样品阳性率分别为7.58%、20.83%、11.76%和0，总阳性率为11.37%，表明云南省普遍存在猪感染BVDV情况。该研究结果为多种家畜混养情况下的BVDV防控提供了理论依据，今后应当提高BVDV与猪瘟病毒（CSFV）二者混合感染检测及其防控的意识。

关键词 猪；牛病毒性腹泻病毒；感染；调查

中图分类号 S858.28 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2023）19-0092-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.19.019

Epidemiological Investigation on BVDV Infection in Pigs in Some Areas of Yunnan Province

XIA Jiu-xian1，2， ZHENG Wang-hua3， WANG Lei1 et al

（1.Yunnan Agricultural University， Kunming，Yunnan 650201;2.Animal Epidemic Prevention and Quarantine Service Center of Xishan District， Kunming， Yunnan  650100;3.Puwen Highway Animal Epidemic Prevention Supervision Station of Yunnan Province， Jinghong，Yunnan 666100）

Abstract In order to understand the infection of pigs with BVDV in some areas of Yunnan Province， 211 fecal samples of pigs at different ages from scattered-fed households and large-scale farms were identified by RT-PCR. The results showed that the BVDV positive rate of fecal samples of pigs in scattered-fed households and large-scale farms were 16.67% and 5.83% respectively， and the positive rates of BVDV in suckling piglets， weaning piglets， fattening pigs and breeding sows were 7.58%， 20.83%， 11.76% and 0 respectively， with a total positive rate of 11.37%. These results showed that pig herds were commonly infected with BVDV in Yunnan Province， which provided the theoretical basis for BVDV prevention and control in the mixed feeding of several kinds of livestock，the awareness of detection，prevention and control of mixed infection of BVDV and CSFV should be improved.

Key words Pig;BVDV;Infection;Investigation

牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）属于黄病毒科瘟病毒属，与猪瘟病毒（classical swine fever virus，CFSV）等病毒存在一定的同源性，且具有结构的相关性和抗原的相关性［1］。依据猪体免疫攻毒、琼脂扩散、中和试验以及免疫荧光试验结果可知，牛病毒性腹泻病毒与猪瘟病毒之间有较强的免疫学关系，2种病毒可溶性抗原相同的概率非常高［2］。由于BVDV感染猪后出现的临床症状与非典型性猪瘟的症状极为相似，加之临床上猪瘟病毒感染出现典型症状的概率较小，在检测猪瘟病毒的过程中时常将BVDV感染误判为猪瘟病毒感染［3-4］。猪被BVDV感染后，体内会形成与猪瘟病毒交叉的中和抗体，导致血清学诊断结果出现错误，从而会影响对BVDV的有效诊断和及时控制；同时，猪感染BVDV后成为一种潜在的传染源，能传染周边的牛和羊，从而造成严重的经济损失［5-6］。BVDV在多种动物之间相互传播还可能会引起该病毒的不断循环和漂移，从而威胁人类健康［7］。此外，猪体内BVDV抗体能够抑制猪瘟病毒，猪感染BVDV后会对猪瘟疫苗的免疫造成影响，导致猪瘟疫苗的效果变差，成为猪瘟防控工作中的不利因素。许多持续性感染处于免疫耐受状态，猪体内不一定产生抗体，处于长期带毒、排毒状态，从而造成BVDV的扩散和传播［3，7］。前期笔者所在科研团队已完成云南省一些地区牛感染BVDV的流行病学调查和毒株分离［8-9］，但对猪感染BVDV的流行病学调查尚未开展。笔者利用RT-PCR检测方法对云南省部分地区猪群开展BVDV流行病学调查，以期为云南省猪瘟的防控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源。

自2020年云南省部分地区不同规模养殖场各生长阶段猪群采集211份粪便样品，其中108份来自散养户，103份来自规模猪场。各生长阶段猪群粪便样品详见表1。

1.1.2 引物合成。

用于扩增BVDV的特异性引物由云南农业大学传染病实验室设计并提供，由昆明硕擎生物科技有限公司合成，TYF1为5′-GAGTACRGGGTAGTCGTCA-3′，TYR1为5′-TCCATGTGCCATGTACAGCAGA-3′，产物预期扩增片段大小220 bp。

1.2 方法

1.2.1 样品处理。

将采集粪样浸入0.9%生理盐水中，用力摇晃使粪便与生理盐水混合，于4 ℃下过夜后将液体转移到新的无RNAase离心管中；4 ℃ 3 000 r/min下离心10 min，将上清液吸到新的无RNAase离心管中；去除粪便残渣，用于核酸提取。

1.2.2 RNA提取。

于2 mL离心管中加入300 μL处理好的粪便样品，加入800 μL RNAiso Plus（TRIzol），上下反复颠倒，使RNAiso Plus（TRIzol）与样品混匀，4 ℃下静置10 min；10 min后再加入160 μL氯仿溶液，上下反复颠倒15 s使两相彻底混匀，4 ℃静置10 min，12 000 r/min离心15 min；小心吸取上层无色溶液约500 μL置于新的1.5 mL无RNAase离心管中，加入等量异丙醇，4 ℃静置10 min，12 000 r/min离心10 min，使RNA沉淀于离心管底部；小心倒去上清液，向离心管内加入1 mL 75%乙醇清洗，7 500 r/min离心5 min；倒去上清液，轻甩后用吸水纸吸干离心管壁的液体，每管加入20 μL DEPC水溶解RNA，瞬时离心，取5 μL RNA加样到1.5%琼脂糖凝胶（含0.2% EB）孔中，150 V电泳15 min，在凝胶成像系统上观察提取RNA的完整性，并使用核酸定量仪定量RNA浓度。

1.2.3 RNA反转录。

反转录体系2×ES Reaction Mix（含10×RT Buffer，dNTPs） 5.0 μL；EasyScriptTM RT/RI Emzyme Mix（含RNase Inhibitor，反转录酶）0.5 μL；下游引物1.0 μL；模板RNA 3.5 μL；总反应体系10.0 μL。反转录程序：42 ℃ 30 min；85 ℃ 5 min。

1.2.4

BVDV检测。以反转录cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系（25.0 μL）如下：2×TransHiFi Ⅱ 12.5 μL、ddH2O 10.5 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、cDNA 1.0 μL。PCR扩增程序如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环35次；72 ℃ 5 min；于4 ℃下暂存。取10 μL PCR扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶（含0.2% EB）电泳15 min后，置于凝胶成像系统下观察并拍照。

2 结果与分析

2.1 BVDV检测

通过BVDV特异性引物进行PCR扩增，对211份粪便样品进行检测和鉴定，所获PCR产物电泳结果与预期目的片段大小（220 bp）相符，确定部分粪便样品BVDV检测呈阳性（图1），其中24份样品BVDV检测呈阳性，阳性率为11.37%（24/211）。

2.2 不同规模猪场BVDV感染情况

由表2可知，从散养户采集108份粪便样品，从规模猪场采集103份粪便样品。通过对PCR产物进行鉴定与统计发现，散养户猪粪便感染BVDV的阳性率为16.67%（18/108）；规模猪场猪粪便感染BVDV的阳性率为5.83%（6/103），表明BVDV感染在猪场普遍存在。

2.3 不同生长阶段猪BVDV感染情况

由表3可知，66份哺乳仔猪粪便样品中检出阳性样品5份，阳性率为7.58%（5/66）；72份断奶仔猪粪便样品中检出阳性样品15份，阳性率为20.83%（15/72）；34份育肥猪粪便样品中检出阳性样品4份，阳性率为11.76%（4/34）；39份种母猪粪便样品中未检出阳性样品，阳性率为0（0/39）。由此可见，不同生长阶段猪感染BVDV的情况不一样，种母猪样品未检出BVDV阳性，这可能是由于样品数量偏少所致。

3 讨论

BVDV感染在牛群中极为普遍［10］，并能通过粪便排泄向外排毒，成为持续的传染源，从而感染多种家畜［11-14］。王新平等［12-13］通过双夹心ELISA方法检测出BVDV在牛、羊、鹿群中的感染率分别为16.5%～89.0%、14.6%～83.3%和19.6%～44.4%，后来从内蒙古哲盟疑似猪瘟病料中首次检出BVDV。

从不同养殖规模来看，散养户送检样品中BVDV阳性检出率高于规模化养殖场，很可能是由于散养户生物安全意识淡薄，养殖过程中存在多种动物混养；同时，该病感染后很少出现明显的临床症状，带毒猪作为传染源难以被发现并淘汰，导致该病的持续传播［14］。该研究首次对云南省猪感染BVDV进行流行病学调查，发现散养户与规模猪场的BVDV阳性率分别为16.67%和5.83%，与孙泉云等［11］对我国猪源BVDV的研究报道相一致，在猪舍条件简陋、生物安全性低、防疫理念差的散养户猪群中BVDV感染情况最严重，因而我国广大农村养猪业者应该引起足够重视，并减少多种牲畜的混喂混养。

从不同生长阶段的猪粪便样品检测结果来看，不同生长阶段的猪感染BVDV的程度不一样。聂兆晶［15］对山东省BVDV流行情况的调查发现母猪和仔猪血清中BVDV抗体阳性率分别为45.3%和32.5%，猪场阳性率达88.5%（23/26）；母猪和断奶仔猪中BVDV的阳性率远高于其他日龄的猪。该研究中哺乳仔猪、断奶仔猪、育肥猪及种母猪BVDV的阳性率分别为7.58%、20.83%、11.76%和0，其中断奶仔猪阳性率较高，而检测的种母猪未感染BVDV。戴爱玲等［16］对福建龙岩规模化猪场猪感染BVDV流行情况进行调查时发现BVDV感染率为28.6%，猪场BVDV阳性率高达94.4%，种猪猪瘟免疫应注意防范BVDV污染。此外，猪被BVDV感染后，体内会形成与猪瘟病毒交叉的中和抗体，导致血清学诊断结果出现错误，最终会影响对BVDV的有效诊断与及时控制［5］；同时，猪感染BVDV后生产力大大降低，并成为一种潜在的传染源，能传染附近的牛群和羊群，从而造成严重的经济损失［6］。因此，在检验检测中应考虑BVDV与CSFV混合感染情况，减少误诊误判。