响应面法优化青钱柳多糖超滤工艺

摘要 以青钱柳发酵液为试验对象，膜通量为评价指标，选择截留分子量为50 kD超滤膜，采用单因素试验、Plackett-Burman试验和响应面试验对青钱柳多糖超滤膜浓缩工艺进行优化。结果表明，最优工艺条件为料液质量浓度1.90 g/mL、料液流量3.0 mL/min、超滤压力123.0 kPa、超滤温度40 ℃、超滤时间24.00 min，在此优化条件下，膜通量为16.01 mL/（m2·min）。

关键词 青钱柳；多糖；超滤；响应面法；工艺优化

中图分类号 R284.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2023）19-0142-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.19.033

Optimization of Ultrafiltration Process for Polysaccharides from Cyclocarya paliurus by Response Surface Methodology

ZHANG Liang1，2，MAO Zi-xin1，2，DENG Shan1，2  et al

（1.Food Fermentation Institute of Jiangxi Province，Yichun，Jiangxi 336023; 2.Food Inspection and Testing Institute of Jiangxi General Institute for Inspection，Testing and Certification，Nanchang，Jiangxi 330001）

Abstract Using the fermentation broth of Cyclocarya paliurus as the experimental object and membrane flux as the evaluation index，and the ultrafiltration membrane with an intercited molecular weight of 50 kDa was selected.Single factor test，Plackett-Burman test and response surface test were used to optimize the concentration process of polysaccharide ultrafiltration membrane.The results showed that the optimal process conditions were as follows：liquid mass concentration 1.90 g/mL，solid-liquid flow rate 3.0 mL/min，ultrafiltration pressure 123.0 kPa，ultrafiltration temperature 40 ℃，ultrafiltration time 24.00 min.Under the optimal conditions，the membrane flux was 16.01 mL/（m2·min）.

Key words Cyclocarya paliurus;Polysaccharide;Ultrafiltration;Response surface methodology;Process optimization

青钱柳［Cylocarya paliurus（Batal.）Iljinskaja］为双子叶植物纲胡桃目胡桃科青钱柳属乔木植物，又名摇钱树、山麻柳、甜茶树等，是现仅存于我国的冰川四纪幸存下来的珍稀树种，广泛分布于我国南方多个省份 ［1-3］。据《中国中药资源志要》记载，青钱柳叶具有一定的清热、消渴、解毒、消肿等功效［4］。在民间，青钱柳叶被炮制成茶来饮用，因其茶汤口感甘甜，故被称为“甜茶”［5］。研究表明，青钱柳中含有多糖、黄酮类物质、三萜类物质等有机活性成分，以及硒、铬、钒、锗等无机营养物质［6-8］。鉴于青钱柳叶具有药食兼用的功效，青钱柳叶已被国家卫生健康委员会批准为新资源食品原料，青钱柳叶茶获得了美国食品药品管理局、日本厚生省和德国卫生部的认可［9］。而作为青钱柳主要活性成分的青钱柳多糖是目前研究的热点，其具有降血糖、降血脂、抗癌、抗氧化等功效［10-11］。

目前，多糖分离纯化的方法主要有水提醇沉法、离子交换树脂法、凝胶过滤柱色谱法、亲和色谱法等［12-14］，但其存在操作复杂、耗时耗能等缺点。相对于传统的提纯方法，超滤膜分离技术具有操作条件温和、分离选择性高、不添加任何化学试剂、耗能低、成本低和节能环保等优势，适用于热敏性天然活性物质的提纯，在植物多糖的提纯方向有着较好的应用［15］。杨亚勇等［16］采用超滤和纳滤膜分离技术提取了发酵液中的阿卡波糖，最终阿卡波糖的含量高于98.8%，提取率也提高了20%（可达到62.2%）；杨祖金等［17］采用卷式的超滤膜来分离提纯灵芝多糖，在6 kD超滤膜、超滤压力0.6 MPa、操作温度45～50 ℃、操作时间 45 min、提取液质量浓度 8.8 mg/mL的条件下，超滤纯化后的灵芝多糖含量为73.5%；杨宁等［18］采用10 kD的超滤膜对仙人掌多糖浸提液进行纯化浓缩，在超滤压力0.20 MPa、超滤温度 25 ℃、料液流量0.04～0.05 L/min、浓缩倍数5～7倍的最优超滤条件下，多糖得率达到了0.95%。采用超滤膜分离技术浓缩青钱柳多糖在国内还鲜有报道。该研究以江西修水县的青钱柳叶制备的青钱柳发酵液为原料［19］，以超滤膜过滤时的膜通量为响应指标，首先用单因素试验及Plackett-Burman试验筛选出对响应值影响显著的因素，再进一步采用响应面试验对青钱柳多糖超滤膜浓缩的工艺进行了优化，为青钱柳多糖的综合利用提供试验基础。

1 材料与方法

1.1 试材与试剂

青钱柳叶，产自江西九江市修水县；发酵液，浓度5.0～6.4 g/mL，江西省食品发酵研究所；苯酚、浓硫酸，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；无水葡萄糖标品，上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

超滤膜，采用复合膜，膜面积为1 m2，山东济南博纳有限公司生产；0.2 μm 微滤膜，山东济南博纳有限公司生产；BONA-GM-18 超滤膜设备，山东济南博纳有限公司生产；T2600 紫外可见分光光度计，青岛精诚仪器设备有限公司；HH-400 恒温水浴锅，上海兰仪实业有限公司；TG-16 高速台式离心机，苏州威尔实验设备有限公司；FA1204电子天平，上海精密科学仪器有限公司；YDJ-200B恒温摇床，英检达仪器（重庆）有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品的制备。

样品采用刘媛洁等［19］工艺条件制备的青钱柳发酵液（多糖含量为3.34 mg/mL），在8 000 r/min条件下对发酵液进行低温离心20 min，取上清液用0.2 μm微滤膜过滤，滤过液用于超滤条件的优化。

1.3.2 青钱柳多糖超滤浓缩工艺。

将青钱柳发酵离心微滤液稀释一定比例后装入超滤设备。超滤开始后截留液会回到料液罐中，透过液流到滤液罐中，调节料液流量、超滤压力、超滤温度、超滤时间等超滤条件浓缩青钱柳发酵液。

1.3.3 青钱柳多糖浓缩工艺优化的超滤膜选择。

在超滤压力 100 kPa、超滤温度 45 ℃和超滤时间 20 min的条件下，采用 200 kD 截留分子量的超滤膜对青钱柳发酵液进行浓缩过滤，滤过液再用 100 kD 截留分子量的超滤膜进行超滤，再依次用50和10 kD 截留分子量的超滤膜对上一级滤过液进行超滤，测定超滤中每段截留分子量超滤膜的截留液和滤过液中青钱柳多糖含量占超滤前青钱柳多糖含量的比例。

1.3.4 青钱柳多糖浓缩工艺优化的单因素试验。

选择使用50 kD的超滤膜，固定超滤优化的单因素试验条件为料液质量浓度2.0 g/mL、料液流量20 mL/min、超滤压力120  kPa、超滤温度 40 ℃、超滤时间 20 min。

以青钱柳发酵液超滤的膜通量为评价指标，依次考察料液质量浓度（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g/mL）、料液流量（10、15、20、25、30、35、40 mL/min）、超滤压力（40、60、80、100、120、140、160 kPa）、超滤温度（20、25、30、35、40、45、50 ℃）和超滤时间（5、10、15、20、25、30 min）对青钱柳发酵液超滤的膜通量的影响。

1.3.5 青钱柳多糖浓缩工艺优化的响应面试验。

1.3.5.1 Plackett-Burman试验设计。

在单因素试验基础上，以膜通量为响应值，选取料液质量浓度（X1）、料液流量（X2）、超滤压力（X3）、超滤温度（X4）和超滤时间（X5） 共5个影响因素，采用Design-Expert 8.0.6软件设计Plackett-Burman试验来筛选出对膜通量影响显著的因素。Plackett-Burman试验设计因素及水平见表1。

1.3.5.2 Box-Behnken试验。

以Plackett-Burman试验的结果来选择对响应值膜通量（Y）影响显著的料液质量浓度（A）、超滤压力（B）和超滤时间 （C）共3个因素为自变量进行Box-Behnken试验优化，具体试验因素及水平见表2。

1.3.6 分析检测。青钱柳多糖含量采用苯酚-硫酸法［19］测定。

膜通量的计算如下：

J=V/（S×T）

式中：J为膜通量［mL/（m2·min）］；V为超滤透过液的体积（mL）；S 为超滤膜有效膜面积（m2） ；T为超滤时间（min）。

1.4 数据处理

Plackett-Burman和Box-Behnken试验的设计采用Design-Expert 8.0.6软件，数据分析采用Design-Expert 8.0.6和SPSS 22软件。

2 结果与分析

2.1 青钱柳多糖浓缩工艺优化时超滤膜的选择

从不同截留分子量超滤膜的滤液中青钱柳多糖含量占比（图1）可以看出，青钱柳发酵液中青钱柳多糖的分子量多集中在50 kD以上，用 50 kD的超滤膜浓缩青钱柳发酵液，截留的青钱柳多糖含量占比可以达到 92.98%。因此，选择50 kD的超滤膜进行青钱柳发酵液超滤浓缩工艺的优化。

2.2 青钱柳多糖浓缩工艺优化的单因素试验

2.2.1 料液质量浓度对膜通量的影响。

由图2可知，随着料液质量浓度的增加，青钱柳多糖膜过滤的膜通量呈现逐渐减少的趋势。当膜通量的质量浓度达到2.0 g/mL以上时，膜通量下降速率明显增大。分析原因可能是随着料液质量浓度的增加，料液中更多的大分子物质更快速地聚集在超滤膜的表面，导致目标物质通过膜的阻力增加，膜通量降低较明显［20］。因此，选择最适料液质量浓度为2.0 g/mL。

2.2.2 料液流量对膜通量的影响。

由图3可知，料液流量在10～30 mL/min时随着料液流量的增加，青钱柳多糖膜过滤的膜通量呈上升趋势；当料液流量为30 mL/min时，膜通量达最大值，为8.91 mL/（m2·min）；当料液流量高于30 mL/min时，膜通量开始降低。分析原因可能是提高料液流量不能降低超滤膜的污染，反而在增加料液流量的同时，也增加了膜表面压力的损失，导致有效压力减少，膜通量也随之减少［21］。因此，选择最适料液流量为30 mL/min。