一株白木香不同组织内生菌的分离鉴定与多样性分析

摘要 ［目的］全面了解百年树龄白木香的可培养内生菌组成。［方法］利用多种培养基对白木香不同组织的真菌和细菌进行分离筛选，结合16S rRNA序列和ITS序列分析，对分离得到的菌株进行初步鉴定。［结果］共筛选得到细菌111株，主要菌属为芽孢杆菌属（Bacillus）、肠杆菌属（Enterobacter）和假单孢菌属（Pseudomonas），分离频率分别为36.03%、22.52%和9.91%；真菌49株，主要菌属为镰刀菌属（Fusarium）、可可毛色二孢菌属（Lasiodiplodia）和炭疽菌属（Colletotrichum），分离频率分别为24.49%、22.45%和20.41%；白木香不同部位内生菌的多样性和结构差异较大，茎干中分离得到的内生菌最多，其中细菌占不同部位细菌总数的86.48%，真菌占不同部位真菌总数的70.59%。［结论］试验结果为人工接菌诱导结香提供了参考并丰富了菌种资源。

关键词 白木香；内生菌；分离鉴定；多样性

中图分类号 Q93 文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2023）20-0006-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.20.002

Isolation，Identification and Diversity Analysis of Endophytic Bacteria in Different Tissues of Aquilaria sinensis

DENG Li1，TANG Bing-feng2，HUANG Wen-zheng1 et al

（1.Guangxi State-own Qinlian Forest Farm，Qinzhou，Guangxi 535000;2.College of Life Science and Technology，Guangxi University，Nanning，Guangxi 530000）

Abstract ［Objective］To better understand the composition of culturable endophytes of Aquilaria sinensis.［Method］A variety of media cultures were used in this study to isolate and screen fungi and bacteria from different parts of Aquilaria sinensis.Combining with 16S rRNA sequence and ITS sequence analysis，the isolated strains were preliminarily analyzed and identified.［Result］A total of 111 bacterial strains were screened，mainly Bacillus sp，Enterobacter and Pseudomonas，with isolation frequencies of 36.03%，22.52%，and 9.91%，respectively.There were 49 fungi strains，mainly Fusarium，Lasiodiplodia and Colletotrichum，with isolation frequencies of 24.49%，22.45% and 20.41%，respectively.The diversity and structure of endophytes in different parts of agarwood were quite unique.The most endophytes were isolated from stems，among which bacteria accounted for 86.48% of the total number of isolated bacteria，and fungi accounted for 70.59% of the total number of isolated fungi.［Conclusion］ The experimental results provide a reference for artificial inoculation to induce aroma formation and enrich bacterial resources.

Key words Aquilaria sinensis;Endophytes;Isolation and identification;Diversity

白木香［Aquilaria sinensis （Lour.） Gilg.］又称土沉香，主要分布在我国南部地区，如海南、广西、广东、云南、香港、台湾等［1］。白木香所产生的树脂是我国和东南亚部分国家的天然香料和传统名贵药物，具有降气温中、暖身纳气的效果［2］，同时能够用于熏香、香水、药物、心脏补品等［3］；从沉香中提取的精油也具有抗菌特性［4］。沉香的高价值引发的商业开发和不受控制的砍伐正在导致这些树木数量的减少，目前8种沉香属的植物被列于《濒危物种国际贸易公约》附录Ⅱ（1994），并被国际自然保护联盟（IUCN，2009）列为易受伤害物种。

沉香为沉香属植物中的树脂，是沉香属植物在受到外来刺激或者损伤之后所产生的次生代谢物［5］，其成分以倍半萜类化合物（如沉香螺旋醇、白木香酸、白木香醛）和色酮类化合物［2-（2-苯乙基）色酮衍生物］为主。国产沉香化学成分的研究表明白木香酸和白木香醛的产生是为了应对某些外来因素刺激的防御［6］，许多学者针对沉香结香原理进行了研究，Wang等［7］揭示了沉香中2-（2-苯基乙基）色酮的生物合成途径。

沉香作为一种名贵的药材，其自然发育需要25～30年，产量较低，无法满足市场需求［5］。该研究对广西境内一株老龄野生白木香的内生菌进行分离鉴定，探究其内生菌结构，了解其内生菌的菌群多样性，分析白木香不同部位的内生菌群结构差异，为功能菌株的发掘、人工诱导结香及研究内生菌群与宿主的相互作用关系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料采集和处理

于2021年9月在广西钦州浦北县某村进行白木香［Aquilaria sinensis （Lour.） Gilg.］样本采集。该树树龄约130年、树高15 m、胸径64.5 cm。在不伤害白木香的前提下，采集根部、叶片、树干表皮有明显病斑部位、表皮以下1～2 cm内层植物组织进行表面消毒后，放入灭菌袋中，编号，保存于4 ℃，并在24 h内对样品进行处理。

1.2 菌株分离纯化 白木香内生真菌的分离与纯化分别使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基和沙氏琼脂培养基；细菌分别使用Luria-Bertani琼脂培养基和牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。

样品分离前，按下列程序进行表面消毒： 分别使用30%过氧化氢和75%乙醇进行表面消毒，消毒结束后使用无菌水漂洗2～3次，漂洗后使用无菌滤纸吸干表面水分。

分离纯化方法：①插块培养法。将消毒后的样品使用无菌手术刀切去表面后，裁成约5 mm的均匀小块，分别插入相应的培养基中，使截面与培养基充分接触，真菌培养基分别添加50 mg/L氨苄西林和50 mg/L卡那霉素，置于（28±1）℃恒温培养箱培养2～10 d。②液培涂布法。将消毒后的样品使用无菌手术刀切去表面后，裁成约5 mm的均匀小块后，用无菌研钵稍加研磨，将样品内部暴露后分别接入相应的液体培养基中，（28±1）℃摇床培养1～3 d。待培养液浑浊后将培养液稀释至10-4和10-5在对应的培养基中进行涂布，涂布后置于（28±1）℃恒温培养箱培养2～10 d。③纯化。待插块样品的培养基和进行液培稀释涂布的培养基上长出菌落后，通过对不同菌落形态特征进行区分，使用无菌接种环分别挑取不同群落接入对应固体培养基中，在（28±1）℃恒温培养箱培养3～5 d，进行纯化分离。

1.3 内生菌的鉴定

1.3.1 真菌的分子生物学鉴定。

将培养基上无法产孢的内生真菌培养一段时间后，从平板上刮取约 1 g 菌丝体，置于1.5 mL 离心管中，使用上海生工DNA提取试剂盒进行内生真菌DNA的提取，并以此为模板，采用真菌通用引物ITS-4F （TCCTCCGCTTATTGATATGC）和ITS-5R（GCAAGTAAAAGTCGTAACAAGG）扩增菌株的ITS序列。PCR 反应体系（50 μL体系）：Taq DNA Polymerase 0.5 μL，ITS-4F和ITS-5R各 4.0 μL，模板 DNA 9.0 μL，双蒸水补足 50 μL。扩增程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s， 50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。 扩增产物用 1.2%琼脂糖凝胶核酸染料电泳检测，将符合要求的扩增产物送至上海生工生物技术有限公司进行测序。

1.3.2 细菌的分子生物学鉴定。

将在培养基上的细菌菌落挑至液体培养基中，37 ℃、200 r/min摇床培养12 h，用枪头吸取10 μL菌液于0.2 mL PCR管中，采用细菌16S通用引物27F（AGAGTTTGATCMTGGCTCAG）和1492R（GGTTACCTTGTTACGACTT ）扩增菌株16S序列。PCR反应体系（25 μL体系）：2× Rapid Taq PCR Master Mix 12.5 μL，16S通用引物27F和1492R各1.0 μL，双蒸水补足25 μL。扩增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s， 54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 5 min。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶核酸染料电泳检测，将符合要求的扩增产物送至上海生工生物技术有限公司进行测序。

1.3.3 内生菌的分子生物学分析。

测得的序列在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上使用Blast工具进行检索比对，选择相似度大于98%以上的序列作为参考序列，并采用ClustalX 2.0 进行同源性比较和匹配排序。

1.4 内生菌多样性分析

该研究采用分离频率、多样性指数等方面分析白木香内生菌的多样性以及分布特性［8］ 。

2 结果与分析

2.1 白木香内生菌的组成

2.1.1 白木香内生细菌的组成。

从所取样品中分离得到内生细菌111株，经形态学和16S rRNA分析，得到的菌株分属于13个属。由表1可知，在门分类水平上分离得到的菌株多为厚壁菌门和变形菌门，在目的分类水平上，芽孢杆菌目和肠杆菌目分离频率较高，分别为45.94%和39.64%；在科的分类水平上，芽孢杆菌科和肠杆菌科分离频率较高，分别为45.94%和33.33%;在属的水平上以芽孢杆菌属（Bacillus）、肠杆菌属（Enterobacter）和假单孢菌属（Pseudomonas）分离频率较高，分别为36.03%、10.83%和9.92%。部分细菌菌落形态如图1所示。

2.1.2 白木香内生真菌的组成。

从所取样品中分离得到内生真菌49株，经形态学和ITS序列分析，得到的菌株分属于10个属。由表2可知，分离菌株均为子囊菌门，在目的分类水平上，肉座菌目、葡萄座腔菌目分离频率较高，分别为36.74%、22.45%；在科的分类水平上，赤壳菌科、葡萄座腔菌科和小丛壳科分离频率较高，分别为24.49%、22.45%和20.41%;在属的水平上，镰刀菌属、可可毛色二孢菌属和炭疽菌属分离频率较高，分别为24.49%、22.45%和20.41%。部分真菌菌落形态如图2所示。