郑州市宠物猫源病原菌毒力基因检测及其耐药性分析

摘要 为了解宠物猫源病原菌常见毒力基因的携带情况及其对临床常用抗菌药物的耐药性，采集宠物医院住院猫的鼻拭子、咽拭子和肛拭子进行病原菌的分离纯化、16S rRNA鉴定，通过PCR扩增检测毒力基因，并通过最低抑菌浓度（MIC值）测定判断药物敏感性及耐药性。共分离到16株大肠杆菌、8株葡萄球菌、3株沙门氏菌和14株肠球菌。16株大肠杆菌中毒力基因OmpA检出率最高，达到100%（16/16）；≥43.75%的猫源大肠杆菌对头孢噻呋、头孢喹肟、多西环素和氟苯尼考耐药；8株葡萄球菌未检测到毒力基因，≥87.50%的葡萄球菌对头孢噻呋、头孢喹肟、多西环素、庆大霉素和阿米卡星耐药；2株沙门氏菌检测到fliC、gipA、mgtC毒力基因，3株沙门氏菌全部对多西环素、庆大霉素、黏菌素耐药，且2株检测到mcr-1 COL耐药基因；14株肠球菌中毒力基因efaA检出率最高，为78.57%（11/14），≥92.86%的菌株对头孢噻呋和阿米卡星耐药。宠物猫源病原菌除葡萄球菌外均携带多种毒力基因，耐药性突出且存在多重耐药性，对替加环素和黏菌素的耐药机制疑是水平传播所致。

关键词 宠物猫；病原菌；毒力基因；耐药性；耐药基因

中图分类号 S852.6 文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2023）20-0086-09

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.20.023

Detection of Virulence Genes and Their Drug Resistance Analysis of Pathogens Isolated from Pet Cats in Zhengzhou City

HAN Rong-jia，PENG Zu-kun，LIU Jian-hua et al

（College of Veterinary Medicine，Henan Agricultural University，Zhengzhou，Henan 450046）

Abstract In order to understand the carrying conditions of common virulence genes of pathogenic bacteria from pet cats and their resistance to commonly-used antibiotics，nasal swabs，pharyngeal swabs and anal swabs from inpatients in pet hospitals were collected for pathogen isolation and purification，16S rRNA identification，PCR amplification for virulence gene detection.And their  drug sensitivity and resistance were judged by the determination of MIC value.A total of 16 strains of Escherichia coli，8  strains of Staphylococcus，3  strains of Salmonella and 14  strains of Enterococcus were isolated.The detection rate of OmpA was the highest in 16 strains of E.coli，reaching 100% （16/16）.≥43.75% of E.coli from pet cats were resistant to CEF，CFQ，DOX and FFC.No virulence gene was detected in 8 stains of Staphylococcus，≥87.50% of Staphylococcus were resistant to CEF，CFQ，DOX，GEN and AMK.fliC，gipA and mgtC virulence genes were detected in two strains of Salmonella，and all three strains of Salmonella were resistant to DOX，GEN and COL， and mcr-1 COL was detected in two strains of Salmonella.The detection rate of efaA in 14 strains of Enterococcus was the highest，being 78.57% （11/14）， and ≥92.86% strains were resistant to CEF and AMK.In addition to Staphylococcus，all pathogenic bacteria from pet cats carried multiple virulence genes，with high and multiple drug resistance.The drug resistance mechanism of Salmonella against TGC and COL was likely to be caused by horizontal transmission.

Key words Pet cats;Pathogen; Virulence genes; Drug resistance; Drug resistance genes

近年来世界各地动物源致病菌耐药现象十分严重，有关宠物源病原菌的耐药性报道亦越来越多。致病性耐药菌株的出现不仅增加了猫临床病原菌感染的治疗难度，而且极易导致宠物与宠物主之间多重耐药菌的横向传播，造成新的公共卫生安全问题。了解本地区猫源病原菌毒力基因的携带情况及其对常用抗生素及抗菌药的耐药情况对于制定合理的临床抗菌治疗方案，减缓人医、兽医致病性耐药菌株的横向传播具有重要意义。

研究表明，对宠物健康造成主要威胁的是致病性强且耐多种药物的病原菌，主要有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和中间型葡萄球菌（MRSP），产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）大肠杆菌、其他肠道菌群，比如产碳青霉烯酶的大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌［1］和沙门氏菌［2］。陈霞等［3］发现从北京市伴侣动物中分离的肠球菌多重耐药情况严重，郭菲等［4］研究发现乌鲁木齐市宠物源大肠杆菌和沙门氏菌对所检抗生素的耐药率在90%以上，可见宠物源病原菌的耐药现象非常普遍。笔者在2021年7—8月收集宠物猫源拭子，对其进行分离鉴定、致病性及耐药性、耐药表型分析，旨在了解宠物临床病原菌的致病性、耐药性，以防止致病性菌株感染人类以及多重耐药菌株的横向传播。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源。试验样品于2021年7—8月在河南农业大学教学动物医院和派德宠物医院采集，采集住院猫鼻拭子、咽拭子和肛拭子共62份。

1.1.2 主要试剂、药品及仪器。主要试剂：Taq Mix酶、BM2000 DNA Marker、50×TAE、1× TE缓冲液、琼脂糖、荧光染料溴化乙锭；麦康凯琼脂、LB琼脂、Baird-Parker培养基、肠球菌琼脂、BHI琼脂、SS琼脂、MH（B）肉汤、LB肉汤。主要药品：头孢噻呋（ceftiofur，CEF）、头孢喹肟（cefquinoxime，CFQ）、多西环素（doxycycline，DOX）、替加环素（tigecycline，TGC）、氟苯尼考（florfenicol，FFC）、庆大霉素（gentamicin，GEN）、阿米卡星（amikacin，AMK）、泰乐菌素（tylosin，TYL）、阿奇霉素（azithromycin，AZM）、替米考星（tilmicosin，TIL）、恩诺沙星（enrofloxacin，ENR）、氧氟沙星（ofloxacin，OFX）、黏菌素（colistin，COL）。以上试剂均购自天驰生物公司；药品一部分购自天驰生物公司，一部分来自笔者所在实验室。主要仪器：超净工作台（型号SW-CJ-2FD，购自苏州安泰技术有限公司）、恒温生化培养箱（型号ZQTY-70V，购自赛默飞世尔科技有限公司）、电子分析天平（型号AB204-N，购自北京锐志汉兴科技有限公司）、紫外/可见分光光度计（型号UV1800PC，购自上海元析仪器有限公司）、离心机（型号5418YQ313640，购自德国Eppendorf公司）、PCR仪（型号ETC811，苏州东盛兴业科学仪器有限公司）、全自动凝胶成像分析系统（型号Genius3，英国Syngene公司）。

1.2 方法

1.2.1 宠物猫源病原菌的分离、纯化与鉴定。无菌拭子样本通过肉汤培养，菌液分别划线接种于麦康凯琼脂培养基、SS琼脂培养基、肠球菌琼脂培养基和Baird-Parker培养基上，过夜培养后挑取单菌落分离纯化3代以上，直至培养基上呈现单一菌落时再进行革兰氏染色镜检及16S rRNA鉴定。

1.2.2 毒力基因PCR检测。根据参考文献［5-8］选择不同菌株目的毒力基因及引物序列（表1～4），引物由擎科生物公司合成。

1.2.3 药物敏感性试验。依据美国临床和实验室标准协会（CLSI）推荐的微量肉汤稀释法测定13种抗生素或抗菌药的最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）；依据CLSI［9］、VET01S［10］推荐标准进行药物敏感性、耐药性结果判定，头孢喹肟（CFQ）耐药折点参考文献［11］。

1.2.4 黏菌素耐药基因检测。质粒介导的黏菌素耐药基因mcr-1是引起黏菌素耐药的主要原因之一［12］。该试验中3株沙门氏菌均对黏菌素耐药。为探究其耐药性是否因mcr-1所致，故对其进行mcr-1检测。依据笔者所在实验室设计的黏菌素耐药基因mcr-1核苷酸序列合成引物，引物序列F为5′-CGGTCAGTCCGTTTGTTC-3′ ，R为5′-CTTGGTCGGTCTGTAGGG-3′，扩增产物长度为320 bp。PCR反应体系、扩增程序和产物凝胶电泳、测序同“1.2.2”。

2 结果与分析

2.1 病原菌分离鉴定结果

病料样本经分离、纯化、革兰氏染色镜检，疑似有大肠杆菌、肠球菌、葡萄球菌、沙门氏菌4种细菌。经16S rRNA 通用引物扩增、凝胶电泳检测，产物送交擎科生物公司测序，测序结果进行Blast比对（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov），鉴定菌株与对应标准菌株的16S rRNA序列同源性均大于99%。从62份猫拭子样品中分离获得大肠杆菌16株，分离率为76.19%（16/21）；获得沙门氏菌3株，分离率为14.29%（3/21）；获得肠球菌14株，分离率为66.67%（14/21）；获得葡萄球菌8株，分离率为38.10%（8/21）。

2.2 毒力基因检测结果

2.2.1 大肠杆菌毒力基因检测。16株大肠杆菌全部检测到目的毒力基因，主要集中在5种毒力基因OmpA、fyuA、iucD、iss和hlyF，16株（100%）携带OmpA基因，12株（75.00%）携带fyuA基因，1株（6.25%）携带iucD、iss和hlyF基因，所有菌株均未检测到irp2、astA和papC基因。大肠杆菌毒力基因PCR扩增结果如图1所示。