糙皮侧耳PoEgt2基因克隆及不同发酵时期表达水平分析

摘要 从糙皮侧耳基因组中预测获得PoEgt2基因进行生物信息学分析和表达分析。结果显示：PoEgt2编码氨基酸546个，为胞内不稳定蛋白，无跨膜区和信号肽。蛋白质序列比对结果显示，糙皮侧耳PoEgt2与白黄侧耳、刺芹侧耳等侧耳属真菌同源性较高，与非侧耳属菌同源性较低。PoEgt2在糙皮侧耳发酵前期的表达量较高，于发酵4 d达到峰值，随后表达水平随时间下降。该研究可为高产麦角硫因的糙皮侧耳菌种改良和发酵条件优化提供科学依据。

关键词 麦角硫因；EGT2；糙皮侧耳；发酵

中图分类号 S646.1+4 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2023）20-0114-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.20.028

Cloning of PoEgt2 Gene from Pleurotus ostreatus and Analysis of Expression Levels at Different Fermentation Stages

TIAN Yuan， PAN Yu， YU Chong et al

（Institute of Microbiology， Heilongjiang Academy of Sciences， Harbin， Heilongjiang 150010）

Abstract In this study， PoEgt2 was predicted from Pleurotus ostreatus genome for bioinformatics analysis and expression analysis. The results showed that PoEgt2 encoded 546 amino acids， which was an intracellular unstable protein without transmembrane region and signal peptide. The results of protein sequence alignment showed that PoEgt2 had high homology with P.cornucopiae and P. eryngii， but low homology with non-Pleuloplegia. The expression level of PoEgt2 was higher in the early stage of fermentation and reached its peak on the fourth day of fermentation， and then decreased with time. This study provided a scientific basis for the improvement of Pleurotus ostreatus strains with high ergothioneine yield and optimization of fermentation conditions.

Key words Ergothioneine;EGT2;Pleurotus ostreatus;Fermentation

糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）又名平菇，为侧耳科侧耳属真菌，是一种价廉、味美、质优的食药兼用真菌［1］，除含丰富的营养物质外，还具有抗氧化［2］、降血糖［3］、抗肿瘤［4］等多种药物功效。糙皮侧耳能产生丰富的生物活性代谢产物，包括甾体类、酚类等次生代谢产物及氨基酸、多糖等多种初生代谢产物［5-7］，是洛伐他汀、木聚糖酶等多种活性物质的重要生产来源［8］。

作为糙皮侧耳合成的重要次级代谢产物，麦角硫因具有抗衰老、抗氧化、抗炎症、延长细胞生存周期、促进神经细胞形成等多种功效［9-12］。由于麦角硫因制备成本较高，因此其应用大多局限于高端化妆品和营养补充剂中。通过生物合成法制备麦角硫因具有原料易获取、产量可提升等优势，生产菌种的选择对于麦角硫因的制备至关重要［13］。研究发现，通过糙皮侧耳发酵生产麦角硫因的水平可达0.2 g/L以上［14］，但其发酵产量仍有提升的空间。尽管糙皮侧耳在生产麦角硫因上具有一定优势，但糙皮侧耳中麦角硫因的合成关键酶基因尚不明确。结合已有研究，推测为可编码具有甲基转移酶与亚砜合酶活性的双功能酶EGT1与PLP结合型C-S裂解酶EGT2［15］。笔者拟利用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增糙皮侧耳的PoEgt2基因，通过采用生物信息学方法进行序列功能分析，并探究其在糙皮侧耳不同发酵阶段的基因表达情况，旨在为高产麦角硫因的糙皮侧耳菌种改良提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种。

糙皮侧耳选育自黑龙江省科学院微生物研究所菌种保藏中心“黑威平菇1号”。

1.1.2 试剂和仪器。

马铃薯葡萄糖水培养基购自海博生物技术有限公司，总RNA提取试剂盒、无缝克隆试剂盒购自Tiangen公司，反转录试剂盒PrimeScript RT Reagent Kit及PCR试剂盒Premix Taq购自Takara公司，DH5α大肠杆菌感受态细胞、胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒购自康为世纪有限公司，SOC培养基、氨苄青霉素购自索莱宝公司，克隆载体pMD19-T购自Takara公司，引物合成及测序服务由上海生工生物工程有限公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 糙皮侧耳的全基因组测序。

糙皮侧耳培养选用马铃薯葡萄糖水液体培养基，挑取“黑威平菇1号”斜面菌种约 1 cm2接种至液体培养基，25 ℃160 r/min摇瓶培养5～7 d至可见明显菌丝。糙皮侧耳菌种的全基因组测序委托上海生工生物有限公司完成。

1.2.2 基因的克隆。

通过对糙皮侧耳基因组进行分析，筛选到一个egt2基因。使用Prime Premier 6.0软件设计蛋白编码区（CDS）全长引物，并委托上海生工生物有限公司合成。引物序列为F（5′-atgctacagtacttttcatttgagc-3′）、R（5′-ctagtccgcgaagaacttcga-3′），提取糙皮侧耳总RNA进行反转录。以反转录获得的cDNA作为模板，PCR扩增获得egt2全长。PCR反应条件为：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；最后72 ℃终延伸5 min。

PCR产物通过1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，经胶回收纯化后，连接至pMD19-T克隆载体上。连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α中，于含氨苄青霉素的SOC琼脂平板上培养，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，阳性菌落送至生工生物工程有限公司完成测序。

1.2.3 生物信息学分析。

基因的开放阅读框。用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）预测基因编码蛋白的分子量和等电点等；利用ProtScale软件（https：//web.expasy.org/protscale/）分析氨基酸序列的疏/亲水性；利用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）绘制蛋白质的三维结构图；利用NCBI的BLASTP（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）完成蛋白质的同源性分析。

1.2.4 qRT-PCR检测PoEgt2在不同发酵时期的表达模式。

利用试剂盒分别提取糙皮侧耳不同发酵时期（2、4、6、8、10 d）的菌丝体总RNA，反转录合成cDNA，然后利用qRT-PCR检测PoEgt2基因在不同发酵条件下的表达量。qRT-PCR的引物为qF（5′-TTCGCCTTACCTGAGTGTCTGTG-3′）、qR（5′-GCAATAGTCGTTGATCGCCTGTTC-3′），以糙皮侧耳β

肌动蛋白（β-actin）基因作为内参基因，参照Takara TB GREEN I试剂盒说明书，利用ABI Step-one荧光定量PCR仪进行扩增。qRT-PCR反应条件为：95 ℃变性10 min；95 ℃变性15 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸40 s，40个循环。基因

相对表达量根据2-ΔΔCt方法计算。

2 结果与分析

2.1 PoEgt2基因克隆

提取糙皮侧耳菌丝体的总RNA，以糙皮侧耳“黑威1号”菌丝体提取的RNA反转录合成的 cDNA 为模板，以PoEgt2-F和PoEgt2-R为引物扩增获得约1 600 bp的目的片段（图1），PCR产物经胶回收后，与pMD19-T克隆载体连接，并转化至大肠杆菌DH5α感受态中。转化菌涂布于平板后，挑取单菌落进行测序分析，结果显示该片段大小为1 641 bp，编码氨基酸546个（图2）。

2.2 PoEgt2基因生物信息学分析

PoEgt2编码蛋白质的理化分析结果表明，推测分子质量为60.48 kD，其理论等电点为8.13，脂肪指数为90.37，亲水性的平均值是-0.030；带负电荷的残基总数是44，带正电荷的残基总数为48，不稳定性指数（Ⅱ）为51.36，该蛋白为不稳定蛋白，未预测到跨膜区和信号肽。用ProtScale在线程序对其亲疏水性、蛋白二级结构进行预测，推测其为亲水性蛋白（图3），其二级结构由40.82% α-螺旋、19.85% β-折叠构象延伸链和33.15%无规则卷曲组成（图4）。SWISS-MODEL构建的EGT2蛋白的三级结构（图5），可见糙皮侧耳EGT2蛋白与已报道的来源于粗糙脉孢霉的C-S裂解酶EGT2相似度为29.93%。

在NCBI上利用BLASTP对糙皮侧耳的EGT2氨基酸序列进行同源序列分析，选择不同物种同源性较高的序列进行比对发现，与其同源性最高的是侧耳属下的真菌，如白黄侧耳（KAG9224528.1，62.45%），刺芹侧耳（KAF9493115.1，57.88%），而同源性最高的非侧耳属菌为白蛋巢属的平滑白蛋巢菌（TFK33142.1，40.58%）。然而，对PoEgt2的BLASTN结果显示，与其他属的真菌序列相似性较低。

2.3 PoEgt2在不同发酵时期的表达模式

为探究PoEgt2在糙皮侧耳发酵生产麦角硫因不同时期的表达情况，使用qRT-PCR方法对其进行定量分析（图6），结果发现，PoEgt2在糙皮侧耳发酵4 d时表达量最高，而在糙皮侧耳发酵10 d时表达量最低，且从发酵4 d开始，PoEgt2的表达水平随时间的延长逐渐下降。

3 结论与讨论

麦角硫因是一类具有较强抗氧化活性的次级代谢产物，主要来源于大型真菌和部分原核细菌，现已应用于保健食品和高端化妆品中，具有较强的市场潜力［16］。当前麦角硫因的获取来源主要为食用菌的子实体，但原材料制备和分离成本高昂，不宜进行产业化［17］。工业化生物发酵有望成为麦角硫因的主流生产方式，然而麦角硫因的生物合成途径相对复杂，不同物种的合成方式有较大差异［18］，且由于麦角硫因主要存在于大型食用菌中，后者作为底盘菌株进行遗传改造的难度较大，发酵周期长，进一步限制了麦角硫因的低成本规模化生产［19］。糙皮侧耳是能够合成麦角硫因的常见食用菌之一，其培养成本低，未经改造发酵水平即可达到102 mg/L（培养4 d），因此有作为底盘菌株进行改良生产麦角硫因的潜力［20］。据报道，麦角硫因的合成主要涉及Egt1和Egt2两个关键酶，在Fe2+和O2存在的条件下，Egt1催化组氨酸甜菜碱和半胱氨酸合成组氨酸甜菜碱半胱氨酸亚砜，再由Egt2催化组氨酸甜菜碱半胱氨酸亚砜转化为麦角硫因［21］。该研究主要进行了PoEgt2基因的克隆、生物信息学和表达水平分析，以期为后期糙皮侧耳的菌种改良提供基因资源和科学依据。