一株黄喉拟水龟致病性维氏气单胞菌的分离鉴定及药敏分析

摘要 ［目的］明确广东省深圳市某养殖场黄喉拟水龟的突发性死亡原因。［方法］采用平板划线分离法对患病龟的肝脏、脾脏等病灶组织分离到一株优势菌，命名为GZW01，对分离菌进行形态特征和生理生化特征的鉴定，利用通用引物27F、1492R对16S rDNA序列扩增，采用DNAMAN及MEGA 6.0等软件进行生物信息学分析该病原菌分类地位。动物回归感染试验验证其致病性，药物敏感试验筛选有效的治疗防控方法。［结果］菌株GZW01为杆状革兰氏阴性菌，其氧化酶活性、葡萄糖酸盐试验、甘露醇、甘露糖、蔗糖、阿拉伯糖、肌醇、覃糖、MR、VP、精氨酸脱羧酶等生理生化鉴定为阳性，可使葡萄糖产气；与NCBI上维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）具有99%同源性；回归感染试验表明菌株GZW01对黄喉拟水龟具有强致病性；药敏结果显示，分离菌株对青霉素G、苯唑西林、氨苄西林、四环素、万古霉素、克林霉素6种药物耐受，对克拉霉素药物中度敏感，对庆大霉素、红霉素、氧氟沙星、氨曲南等28种抗生素高度敏感。［结论］引发深圳市某养殖场黄喉拟水龟的突发性死亡的致病菌为维氏气单胞菌。

关键词 黄喉拟水龟；维氏气单胞菌；分离；鉴定；药敏试验

中图分类号 S917.4 文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2023）20-0109-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.20.027

Isolation， Identification and Drug Susceptibility Analysis of a Pathogenic Aeromonas vickerii Strain from Mauremys mutica

ZHOU Han1，2，HUANG Yu1，JIAN Ji-chang1 et al

（1.Fisheries College，Guangdong Ocean University/Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Animal Disease Control and Healthy Culture，Zhanjiang，Guangdong 524088;2.Shenzhen Fishery Development and Research Center， Shenzhen， Guangdong 518108）

Abstract ［Objective］To identify the sudden death causes of Mauremys mutica in a breeding farm in Shenzhen， Guangdong Province.［Method］A dominant strain named GZWO1 was isolated from the liver， spleen and other focal tissues of the infected Mauremys mutica by the scribing plate separation method. The morphological characteristics， physiological and biochemical characteristics of the isolated strain were identified， and the general primers were used： 16SrDNA sequence was amplified by 27F and 1492R， and the classification status of the pathogen was analyzed by using DNAMAN and MEGA-6.0 software. The pathogenicity of the pathogen was verified by animal regression infection test， and effective treatment and prevention methods were screened by drug sensitivity test.［Result］Strain GZW01 was a rod-like gram-negative bacterium. Its enzyme activity， gluconate test， mannitol， mannose， sucrose， arabinose， inositol， Tanose， MR， VP， arginine decarboxylase and other physiological and biochemical tests were positive， which could produce glucose gas. It had 99% homology with Aeromonas veronii on NCBI. The regression infection test showed that strain GZW01 was highly pathogenic to Tenebrio flavus. The results of drug sensitivity showed that the isolated strain was resistant to penicillin G， benzoxicillin sodium， ampicillin， tetracycline， vancomycin， clindamycin， and a total of six drugs. It was moderately sensitive to clarithromycin; and highly sensitive to 28 antibiotics such as gentamicin， erythromycin， ofloxacin and amtrannan.［Conclusion］Aeromonas veronii was the pathogenic bacterium that caused sudden death of the Mauremys mutica in a breeding farm in Shenzhen City.

Key words Mauremys mutica;Aeromonas veronii;Isolation;Identification;Drug sensitivity test

黄喉拟水龟（Mauremys mutica），别名石金钱，隶属爬行纲（Reptilia），20世纪80年代以后被引入日本，成为外来入侵种。与世界许多生物一样，过度捕猎和栖息地丧失等因素导致其野生资源几近枯竭。现如今规模化养殖目前已经形成，在饲养过程中，黄喉拟水龟易发生大规模暴发性疾病，病龟食欲不振，行动迟缓，器官受病菌感染，最终衰竭死亡，给养殖户带来极大的经济损失。资料显示，黄喉拟水龟曾在2000和2016年均被记录为濒危物种，在2010年被记录为极度濒危物种［1］，在国际贸易中受到严格管控［2］。黄喉拟水龟的食用、药用和观赏价值较高，在人工养殖条件下，细菌类疾病是导致黄喉拟水龟发病的主要原因［3］。目前，有关龟类的病害防治受到重视，不同症状的龟类其病原菌的鉴定结果不同。王苗等［4］曾在草龟身上分离出一株致病菌，经鉴定结果为维氏气单胞菌的一株；时少坤等［5］于患有红脖子病黄喉拟水龟中分离到嗜水气单胞菌。已有相关报道表明维氏气单胞菌已逐渐成为威胁人类健康的重要病原菌［6］，维氏气单胞菌可污染畜禽等肉类、水产品、人，可引发人患胃肠炎、腹膜炎、脑膜炎、败血症、泌尿道和外伤感染。国内外对维氏气单胞菌的研究与其他人畜共患的病原菌相比并不成熟［7］。广东省深圳市福田区某养殖场患病龟主要症状有食欲不振、精神萎靡、行动迟缓、眼睛肿大、充血、全身或局部感染、排便增多、水便、急性腹泻等，身体伴有明显异味。笔者对从原始发病黄喉拟水龟的肺、脾脏、肝脏中进行病原菌分离，经生理生化试验、16S rDNA序列分析动物回归感染试验判断其生物学地位及致病性，并通过药敏试验分析病原菌的药物敏感性，以期为控制该病原菌感染和致病机理研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

对广东深圳某养龟场患病黄喉拟水龟采样并采购同一养殖场的健康黄喉拟水龟（体重80～90 g），实验室条件下饲养15 d确定健康后用于回归感染试验。

革兰氏染色试剂盒、培养基、细菌生理生化鉴定试剂盒、药敏试剂盒购自广东环凯微生物科技有限公司；分子生物学测序鉴定分析由华大基因科技有限公司完成。

1.2 病原菌的分离纯化

无菌条件下，从肺、脾脏、肝脏病灶组织进行细菌分离纯化，在营养琼脂（NA）培养基上划线［8］，28 ℃过夜培养，挑取生长良好、形态规格一致且数量多的菌落进行传代培养，并进行后续鉴定分析。

1.3 病原菌的鉴定

1.3.1 革兰氏染色。

挑取单克隆菌落涂布在滴有无菌生理盐水的载玻片上，自然风干，在酒精灯火焰上固定加热。按照革兰氏染色试剂盒说明书进行染色观察。

1.3.2 生理生化鉴定。生理生化试验按照环凯科细菌生化编码鉴定管试剂盒说明书进行。

1.3.3 细菌16S rDNA鉴定。

用CTAB法提取单克隆菌落的DNA，利用华大基因科技有限公司合成的16S rDNA通用引物27F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）、1492R（GGTTACCTTGTTACGACTT）。PCR扩增产物经琼脂糖电泳检测［4］，随后将PCR产物送至华大基因科技有限公司进行序列测定。

1.3.4 构建系统发育进化树。利用NCBI的BLAST功能进行测序获得的16S基因比对分析并进行系统进化树构建。

1.4 病原菌药敏试验

将目标病原菌画线接种于NA培养基，28 ℃过夜培养至稳定期，挑取3～5个菌落于1 mL灭菌生理盐水，振荡均匀，用无菌棉签沾取菌液均匀涂布于MH固体培养基中，每个平板均匀贴布5片药敏片，28 ℃培养箱过夜后观察并测量，根据说明书对比抑菌圈的直径来判断对抗生素的敏感程度。

1.5 病原菌感染试验

试验龟用无菌生理盐水清洗。将已培养至稳定期病原菌株，用分光光度计进行菌液浓度测定，并根据陆专灵等［9］的方法用无菌磷酸盐（PBS）缓冲液将菌液稀释成109、108、107、106、105、104、103 CFU/mL 7个梯度，腹腔注射龟体，每组8只，每只100 μL，对照组注射等量PBS缓冲液100 μL，接种后观察龟的发病情况，并分离鉴定病原菌和重复感染试验。

2 结果与分析

2.1 患病黄喉拟水龟剖检 自然患病黄喉拟水龟腹甲肿胀，剖检后体内肝脏充血变脆并伴有腐臭，脾、肠道等器官充血（图1）。

2.2 生理生化鉴定

从患病黄喉拟水龟病灶分离纯化出数量最多、长势最好的菌株，命名为GZW01；革兰氏染色结果显示为杆状，革兰氏阴性菌（图2），在普通固体琼脂培养基上形成圆形，光滑，边缘整齐，灰白色菌落（图3）。

将分离纯化后的单菌落接种于生化鉴定管，37 ℃培养24～48 h后进行观察（不同项目培养时间不同，需参照说明书），菌株GZW01的VP试验、MR试验阳性，3% NaCl三糖铁试验显示不能产生硫化氢，能分解蔗糖、葡萄糖；氧化酶阳性；覃糖、1% NaCl甘露醇、1%NaCl甘露糖、1%NaCl肌醇反应结果呈阳性等生理生化特性（表1）与《伯杰氏细菌鉴定手册》中关于维氏气单胞菌的鉴定结果相同［10］。将测序序列在NCBI进行同源比对显示与维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）同源性达99%（图4）。综上结果，菌株GZW01可鉴定为维氏气单胞菌。

2.3 病原菌药敏试验

GZW01分离菌株对抗生素（35种）敏感性结果（表2）显示，菌株对庆大霉素、红霉素、氧氟沙星、氨曲南等药物高度敏感，数量为28种；对克拉霉素药物中度敏感；对青霉素G、苯唑西林、氨苄西林、四环素、万古霉素、克林霉素耐受。