拮抗水稻病原菌假单胞菌AH菌株的鉴定及全基因组序列分析

摘要 ［目的］探究菌株AH的生防潜力和基因组序列信息，以解析其防病机制，挖掘次级代谢产物基因资源。［方法］采用稀释涂布平板法分离水稻的叶际微生物，筛选具有拮抗效果的菌株；根据形态学、16S rDNA和gyrB基因测序和系统发育分析，鉴定其种属；利用平板抑菌试验明确其抑菌谱；大田喷施菌悬液明确其防治效果。继而，利用第二代Illumina与第三代PacBio结合的测序方法对生防菌进行全基因组测序，对测序数据进行基因组组装、基因预测与功能注释、次级代谢产物合成基因簇预测等分析。［结果］AH是一株短杆状恶臭假单胞菌株，对稻瘟病菌、茎点霉菌、水稻纹枯病菌和水稻黄单胞菌具有广谱抗菌活性，且田间施用AH菌液可显著降低水稻白叶枯病和稻瘟病的病害等级。抗生素敏感性测试揭示菌株AH对氨基糖苷类抗生素高度敏感。AH基因组全长为5 889 125 bp，编码5 215个基因，GC含量为63.74%，有19个rRNA、77个tRNA和78个nRNA，antiSMASH预测得到8个次级代谢产物合成基因簇。［结论］AH菌株具有良好生防潜力，深层机制解析可为病害防控提供科学依据。

关键词 恶臭假单胞AH；生物防治；稻瘟病；水稻白叶枯病

中图分类号 S435.11 文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2023）20-0138-09

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.20.034

Identification and Whole Genome Analysis of Pseudomonas putida AH Strain Antagonistic to Rice Pathogens

HU Yi-qun，SHEN Wen-jie，CHEN Qing-qing et al

（Institute of Plant Protection and Agro-products Safety，Anhui Academy of Agricultural Sciences，Hefei，Anhui 230001）

Abstract ［Objective］Biocontrol potential and genome information of strain AH were analyzed to reveal mechanism of disease prevention and explore gene resources of secondary metabolites.［Method］The method of spreading plates was used to screen antagonistic strains from rice leaves.The species was identified by morphological，16S rDNA and gyrB sequencing and phylogenetic analysis.The flat standoff test and spraying bacterial suspension in field clarified its biocontrol potential.Subsequently，the genome sequence of AH strain was obtained using a third generation Pacbio SMRT sequencing platform and second-generation Illumina sequencing technology.Then，genome assembly，gene prediction，function annotation，and secondary metabolite biosynthetic gene cluster prediction were performed.［Result］AH was a short rod strain，belonged to Pseudomonas putida，and showed broad-spectrum antimicrobial activity against Magnaporthe oryzae，Phoma sp.，Rhizoctonia solani，and Xanthomonas oryzae.Spraying AH suspension significantly reduced disease grade caused by bacterial blight and blast disease.Antibiotic susceptibility testing revealed that AH showed high sensitivity to aminoglycoside antibiotics.The total length of AH genome was 5 889 125 bp，encoding 5 215 genes with 63.74% GC content，including 19 rRNA，77 tRNA and 78 nRNA.And，eight secondary metabolite synthesis gene clusters were predicted by antiSMASH platform in AH genome.［Conclusion］Based on good biocontrol potential of AH strain，the analysis of deep mechanism can provide scientific basis for disease prevention and control.

Key words Pseudomonas putida AH;Biocontrol;Rice blast;Rice bacterial blight

为缓解农药过度施用与环境保护之间的矛盾，微生物来源的生防菌剂或制品有较好的开发前景。假单胞菌属、芽孢杆菌属和木霉属来源的微生物，对多种植物或动物病原菌具有良好的抑菌活性，因此被广泛用作生物防治剂［1-4］。假单胞菌属具有代谢多样性的特点，可产生多种次级代谢产物，如吩嗪类物质（phenazines）、硝吡咯菌素（pyrrolnitrin）、2，4-二乙酰基间苯三酚（2，4-diacetylphloroglucinol）、黄绿菌素（pyocyanin）和环脂肽（cyclic lipopeptides，CLPs）等。此外，假单胞菌属细菌也能通过诱导系统抗性的方式，抑制病原菌定殖或生长，对植物具有保护作用［5-8］。铜绿假单胞菌P.aeruginosa UPMP3菌株合成的吩嗪粗提物，可显著减轻狭长孢灵芝引起的油棕榈茎基底感染［9］。从苹果花上分离的P.oriental F9菌株表现出对火疫病菌的良好拮抗特性［10］。此外，大多数假单胞菌属菌株可作为植物根际促生菌，分泌生长调节剂来增强植物防御病原菌的能力。从印度青蒿根际分离的P.aeruginosa可以促进植物生长，且对植物病原菌链格孢、黄曲霉和尖孢镰刀菌表现出很好的生防活性［11］。

恶臭假单胞P.putida与近缘物种P.fluorescens和P.brassicacearum可作为生物防治剂和植物生长促进剂［12-13］。P.putida与其他有益微生物复合施用时，显著增加了水果营养元素的含量［14-15］。P.putida B2017菌株通过产生铁载体pyoverdine来抑制植物病原菌［16］。在有益于植物的同时，生防菌也需要使自己免于如活性氧爆发之类的快速且强烈的植物防御反应所导致的损伤。P.putida RRF3通过改变根部基因的转录表达来刺激植物产生防御反应，并通过改变根际的化合物组分来保护自身［17］。

一直以来，我国稻米主产区的真菌、细菌病害频发，稻瘟病菌可在水稻营养生长期侵染叶片导致叶瘟，在生殖生长期侵染稻穗导致穗颈瘟，严重降低稻米产量和品质［18］。镰孢菌Fusarium的复合侵染，如藤仓镰孢菌F.fujikuroi、层出镰孢菌F.proliferatum、拟轮枝镰孢菌F.verticillioides等，会降低种子发芽率，或引起水稻恶苗病［19］。此外，黄单胞菌Xanthomonas是一类重要的植物病原细菌，可侵染400多种植物，包括稻、棉、豆等粮食作物和柑橘、香蕉和木薯等经济作物［20］。其中，X.oryzae pv.oryzae和X.oryzae pv.oryzicola是稻黄单胞的2个致病变种，分别引起水稻白叶枯病和细菌性条斑病，危害严重［21-22］。面对防病增产与生态保护之间日益突出的矛盾，广谱抑菌菌株的开发利用是减少化学制剂使用、降低环境污染的有效策略。

叶际微生物的生境更为复杂多变，具备良好的环境适应性和多种生防机制。基于此，笔者通过分离水稻叶片微生物、平板对峙筛选拮抗菌株、多基因测序和系统发育分析鉴定得到一株具有良好抗菌活性的恶臭假单胞P.putida AH菌株，田间试验明确其对水稻白叶枯病和稻瘟病具有防治效果。利用第二代Illumina与第三代PacBio结合的方法进行全基因组测序，并对测序数据进行基因组组装、基因预测与功能注释、次级代谢产物合成基因簇分析，为AH菌株的基因功能研究提供分子遗传信息。恶臭假单胞P.putida AH菌株的研究可为水稻病害防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株和培养条件

稻瘟病菌Magnaporthe oryzae、纹枯病菌Rhizoctonia solani、茎点霉菌Phoma sp.、水稻白叶枯病菌Xanthomonas oryzae pv.oryzae、尖孢镰孢菌Fusarium oxysporum、层出镰孢菌F.proliferum、短小杆菌Curtobacterium sp.，均保存于笔者所在实验室。细菌培养用LB培养基，白叶枯病菌培养用NA培养基，培养条件为28 ℃，保存介质为50%甘油。真菌培养用PDA培养基，培养条件为28 ℃，无菌滤纸对菌丝块进行低温保存。

1.2 稻瘟拮抗细菌的分离和筛选

为从水稻叶际分离稻瘟病菌的拮抗细菌，用无菌剪刀将水稻叶片组织切成小块，在无菌水中浸泡30 min，6 000 r/min 离心3 min获得上清液。将悬浮液进行梯度稀释（10-2、10-3、10-4、10-5），取不同浓度的稀释液50 μL涂布于3个LB板上，平板于28 ℃培养2 d。挑取形态差异的单菌落进一步纯化保存，用于拮抗菌的筛选。稻瘟病菌孢子液稀释至2×107个/mL，涂布PDA平板后，28 ℃培养3 d。取2 μL上述细菌菌液滴于上述平板，28 ℃培养3 d，周围有抑菌圈的细菌即为目的菌，纯化并保存。

1.3 拮抗细菌的形态观察

取20 μL新鲜菌悬液滴到碳膜铜网，静置5 min后用滤纸吸去多余液体。将2%磷钨酸滴在碳膜铜网，静置染色2 min后用滤纸吸去多余液体，室温干燥。在透射电子显微镜下观察细菌形态，采集图像分析。

1.4 细菌分类鉴定 利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。使用细菌通用引物［23］扩增16S rDNA基因（27F，5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′;1492R，5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。使用特异性引物扩增gyrB序列（F，5′-GAGCAGACCTACGTCCACGGTGTG-3′;R，5′-GTCGATCATCTTGCCAACGACCGC-3′）。PCR扩增产物经过纯化后送生工生物技术公司进行测序。测序结果与BLAST（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中核酸数据进行比对，选择同源性较高的近缘物种序列，利用MEGAX软件使用邻接法构建系统发育树。