野生生境青刺果根际土壤细菌群落结构多样性分析

摘要 探究在野生环境条件下，青刺果根际与非根际土壤细菌群落组成及多样性特征，为发展青刺果产业、优化青刺果植物生长状态及微生物资源开发利用提供理论依据。以生长在野生环境条件下，青刺果根际与非根际土壤为材料，通过HiSeq平台高通量双末端测序获得根际与非根际土壤内生细菌16S rRNA基因V3～V4区域序列，对其根际与非根际土壤细菌群落结构组成进行生物信息学分析。结果表明，青刺果根际与非根际土壤细菌主要由110个属组成，归属于11个门。相对丰度较高的门是Proteobacteria（变形菌门），其次是Acidobacteria（酸杆菌门）、Actinobacteria（放线菌门）。在纲分类水平上，根际土壤细菌特有的菌纲为Deinococci（异常球菌纲）、Elusimicrobia、Fibrobacteria（纤维杆菌纲）。非根际土壤细菌特有的菌纲为Negativicutes（厌氧菌纲）。在属分类水平上，酸杆菌亚属（Acidobacterium）总丰度最高，为优势属；丰度大于1%的根际、非根际土壤细菌分别有9个属和11个属。通过LEfSe聚类树分析，青刺果根际与非根际土壤细菌起到重要作用的微生物类群biomaker在丰度上存在显著差异。基于基因功能预测显示，青刺果根际与非根际土壤细菌群落主要涉及碳水化合物代谢、萜类化合物和聚酮类化合物代谢、细胞运动、氨基酸代谢和信号转导机制等27个二级功能，均表现出功能上的多样性和丰富性。通过对青刺果根际与非根际土壤细菌群落结构组成分析，明确了生长在野生环境下的青刺果植株，其土壤细菌群落多样性丰富，群落组成间存在共性与差异性；同时发现青刺果潜在食品安全风险。

关键词 青刺果；根际内生细菌；非根际内生细菌；16S rRNA测序

中图分类号 S154.3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2023）22-0148-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.22.036

Analysis of Bacterial Diversity and Community Structure in the Rhizosphere of Wild Prinsepia utilis Royle

ZHENG  Peng   ZHANG  Yue1

（1.Lijiang Teachers College， Lijiang， Yunnan 674100;2.Plateau Characteristics Agricultural Research Centre of Northwestern Yunnan， Lijiang， Yunnan  674100）

Abstract The composition and diversity of bacterial communities in rhizosphere and non-rhizosphere of wild Prinsepia utilis Royle were explored in order  to provide a theoretical guidance for the development of Prinsepia utilis Royle industry and the optimization of its growing conditions. Moreover， to provide a theoretical guidance for the development and utilization of microbial source.Endophyte bacterial communities in rhizosphere and non-rhizosphere of wild Prinsepia utilis Royle were tested by a HiSeq high throughput sequencing method， followed by bioinformatics analyses targeted at V3-V4 regions of the 16S rRNA gene. The results showed that the bacterial endophyte communities in rhizosphere and non-rhizosphere of wild Prinsepia utilis Royle were mainly composed of 110 genera， belonging to 11 phyla. At the phylum level， the phylum Proteobacteria was found to be the highest in total abundance across all samples， followed by Acidobacteria and Actinobacteria. At the level of class distribution， Deinococci， Elusimicrobia and Fibrobacteria were only found in rhizosphere soil. In addition， Negativicutes was only found in non-rhizosphere soil. Acidobacterium was the most dominant bacterial genus， which was the highest in abundance. There were 9 and 11 genera of rhizosphere and non-rhizosphere soil bacteria with abundance greater than 1%， respectively. Through the analysis of LEfSe， significant differences were found in the abundance of microbial group biomarker， which played an important role in the rhizosphere and non-rhizosphere soil bacteria. Furthermore， gene function prediction showed that the bacterial endophyte communities were mainly related to 27 sub-functions including the carbohydrate metabolism， metabolism of terpenoids and phlyketides， cell motility， amino acid metabolism， signal transduction， and so on. They all presented the diversity and abundance in functions. By analyzing the com`position and structure of bacterial communities in rhizosphere and non-rhizosphere of wild Prinsepia utilis Royle， rich diversity was found in its bacterial communities. Similarities and differences were existed. At the same time， the potential food safety risks were found in Prinsepia utilis Royle used as food.

Key words Prinsepia utilis Royle;Endophytic bacteria in rhizosphere;Endophytic bacteria in non-rhizosphere;16S rRNA sequencing

健康的土壤是维持土壤生态系统服务功能的关键，一个具有高生物多样性的健康土壤一定具有较为优良的理化性质［1］。土壤中蕴藏着巨大微生物多样性，是联系大气圈、水圈、岩石圈及生物圈物质与能量交换的重要纽带，而每克土壤中，高达99%的物种及其功能尚属未知［2］。土壤微生物多样性可以敏感地反映土壤环境的微小变化，能够监测土壤质量变化，是土壤生态系统的重要生物学指标［3］。研究表明，微生物多样性越高，土壤将表现出更多的生态功能、病虫害抵抗力、抗环境胁迫性和更高的作物生产能力［4-6］。

早在1904年，德国学者Hiltner就提出了“根际”一词，按相关微生物提供的定植生态位特性，可细分为根际（rhizosphere）、根表（rhizoplane）和根系内部（endorhiza），近年来，根际微生物组的巨大潜力在相关的研究中得到证实［7］。了解内生细菌多样性有助于阐明它们的功能和潜在作用，进而优化植物生长状态［8］。根际微生物的群落结构、数量变化会直接影响地上植物对营养物质和水分的吸收及植物的抗逆性［9］。植物生长过程中释放20%～60%的光合产物，如糖、有机酸等进入根际微域，根系分泌物在碳、氮、硫等循环中发挥重要作用，从而改变根系的释水特性和根际土壤养分浓度，影响根际土壤微生物的活动，进而影响植物的生长［10］。研究表明，植物根系选择性地招募特定的土壤微生物，如变形杆菌（Proteobacteria）、放线菌（Actinobacteria）等，而微生物特异性富集也取决于植物根际区系、土壤类型、营养状况和发育阶段等因素［11］。

目前，国内外研究集中在从青刺果中分离鉴定单体化合物如L-表儿茶素、β-谷甾醇-β-葡萄糖苷等［12］，以及青刺果果实酚类成分和相关抗氧化特性［13-14］等方面；对青刺果根际土壤微生物多样性相关研究尚未见报道。因此，探究青刺果根际微生物多样性的影响，对改善青刺果根际土壤菌群结构及促进青刺果生长和土壤肥料的施用具有重要意义。

青刺果（Prinsepia utilis Royle），是一种较耐旱并与滇西北少数民族共同生活了几千年的野生植株，也是丽江市政府大力推广退耕还林的主要树种。青刺果又名总花扁核木，是蔷薇科李亚科扁核木属植物［15］，生长在海拔2 200～2 700 m中国南部和印度的北部［16］，全株可以入药，种子可榨油，是一种天然的高级食用油。目前，高通量测序已被广泛应用于污水、土壤和深海等复杂环境的微生物多样性分析中［17］。高通量测序技术不需要分离培养，直接从DNA层面进行种群组成分析，并可提供更加丰富的细菌多样性相关信息［18］，因而，高通量测序已被越来越多地应用于微生物群落结构及群体多样性分析中。

探究植物根际微生物群落特征及微生物多样性分析，有助于能够准确掌握植物根际土壤微生物群落丰度及微生物群落多样性水平上的变化。笔者以青刺果为研究对象，采用高通量测序技术对青刺果根际与非根际土壤内生细菌菌群丰度、多样性及潜在功能进行深入全面分析，为全面揭示野生生境青刺果根际与非根际土壤内生细菌群落结构差异、功能菌株的挖掘和对环境条件变化引起的土壤细菌菌落动态变化提供参考，并为今后人工大面积栽培青刺果植株土传病害、优化植株生长及土壤生态系统奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2021年1月11日，于云南省丽江市（100°20′E，26°53′N，海拔2 686 m），选择青刺果子房膨大期采样，随机选择3株，分别采集青刺果根际土壤和非根际土壤，共采取土样6份带回实验室，获得2组平行样品（非根际土壤与根际土壤），编号分别为A组、B组。

青刺果根际、非根际土壤采集方法采用吴秋芳等［19］的方法。挖取青刺果植株根系，抖动根部松散系土壤，用消毒的刷子收集粘在青刺果根际的土壤至2 mL离心管中，视为青刺果根际土壤样品；而非根际土壤为距离青刺果根系表面5～10 cm范围内5～20 cm的土壤；装入无菌袋中，过100目筛，于-80 ℃中保存。

1.2 土壤样品基因组DNA提取及16S rRNA扩增测序

土壤样品微生物群落DNA提取采用NucleoSpin Soil kit（Macherey-Nagel，Germany）试剂盒；用qubitdsDNA BR（Invitrogen，USA）及 qubit荧光计，检测其浓度和纯度。测序靶标DNA为16S rRNA基因V3～V4可变区，所用引物为341F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG- 3′）和806R（5′ -GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3′）。正反向引物标记有Illumina adapter序列。取质量合格的基因组DNA样品30 ng及对应的融合引物配制PCR反应体系（50 uL）。PCR反应条件：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，30个循环，72 ℃延伸10 min。使用Agencourt AMPure XP磁珠对PCR扩增产物进行纯化并溶于Elution Buffer，贴上标签，完成建库。使用Agilent 2100 Bioanalyzer对文库的片段范围及浓度进行检测。检测合格的文库根据插入片段大小，选择HiSeq平台进行测序。以上工作由华大基因科技有限公司（武汉分公司）完成。

1.3 数据分析

将能匹配到引物的reads，用软件cutadapt v2.6截取掉引物和接头污染，得到目标区域片段；采用按窗口去低质量的方法：设置25 bp为窗口长度，如果窗口平均质量值低于20，从窗口开始截除read末端序列，移除最终read长度低于原始read长度75%的read。去除含N的reads；去除低复杂度的reads（连续10个ATCG），最终得到Cleandata。序列拼接使用软件FLASH（Fast length Adjustment of short reads，V1.2.11），质控指标（最小匹配长度15 bp；重叠区域允许错配率为0.1）利用重叠关系将双末端测序得到的成对reads组装成一条序列，得到高变区的Tags。利用软件USEARCH（v7.0.1090_i86linux32）将拼接好的Tags按照97%序列相似性聚类生成OTU。得到OTU代表序列后，通过RDP classifer（1.9.1）软件将OTU代表序列与数据库比对进行物种注释，置信度阈值设置为0.6，对注释结果进行如下过滤：去除没有注释结果的OTU；去除注释结果不属于分析项目中的物种。最终采用RDP classifier贝叶斯算法对OTU代表序列进行分类学分析，并在界门纲目科属种水平统计各样本的群落组成。