烟叶废弃物中绿原酸的提取与应用研究进展

摘要 绿原酸是烟叶中含量最高的多酚类物质，中国作为烟草种植大国，每年烤烟生产过程中会产生大量的低次等废弃烟叶，从废弃烟叶中提取与纯化出具有广泛应用价值的绿原酸是烟叶综合利用的重要途径。综述了烟草中绿原酸的提取、纯化和检测方法，对比分析了不同提取工艺、纯化方法和检测方法的应用以及各自的优势与不足，并对绿原酸的生物活性和药理活性作用进行了详细综述，以期为后续烟草等植物中绿原酸的提取与利用提供科学的方法与理论指导。

关键词 烟草;绿原酸;提取工艺;生物活性;研究进展

中图分类号 TS 49  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2022）06-0016-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.06.004

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Research Progress on Extraction and Application of Chlorogenic Acid from Tobacco Waste

JING Hao，GUO De-min，XIONG Wei （Tobacco Monopoly Bureau of Tibet Autonomous Region，Lhasa，Tibet 850000）

Abstract Chlorogenic acid is the highest content of polyphenols in tobacco leaves.As a large tobacco planting country，China produces a large amount of low-grade waste tobacco during the production process of flue-cured tobacco every year.Extracted and purified from waste tobacco leaves has a wide range of applications.Chlorogenic acid is an important way for comprehensive utilization of tobacco leaves.The extraction，purification and detection methods of chlorogenic acid in tobacco are reviewed，and the application of different extraction processes，purification methods and detection methods as well as their respective advantages and disadvantages are compared and analyzed.The biological and pharmacological activities of chlorogenic acid are analyzed.A detailed review is provided in order to provide scientific methods and theoretical guidance for the subsequent extraction and utilization of chlorogenic acid in tobacco and other plants.

Key words Tobacco;Chlorogenic acid;Extraction process;Biological activity;Research progress

基金项目

中国烟草总公司西藏自治区公司科技创新项目（QJ- JG-2021-04）。

作者简介 景浩（1988—），男，河南巩义人，助理工程师，从事烟草及烟草制品检验工作。*通信作者，博士，从事烟草检验分析研究。

收稿日期 2021-05-08;修回日期 2021-07-10

绿原酸（chlorogenic acid）是植物有氧呼吸过程合成的一种苯丙素类化合物，是由奎尼酸与咖啡酸组成的缩酚酸。绿原酸是杜仲、金银花和茵陈等中药材的主要有效成分之一[1]，具有抗氧化、抗病毒、免疫调节、降糖降脂等多种药理作用[2-3]，近年来在医药、化工和食品[4]等领域都有应用。

绿原酸易溶于甲醇、丙酮和乙醇等有机溶剂，难溶于乙醚、苯和氯仿。由于绿原酸的分子结构中含有不饱和双键和酯键以及多元酚，分子中的邻二酚羟基极易被氧化，受热、见光都能使其生物学活性丧失，在酸性环境较碱性环境中更稳定[3]。由于其不稳定、难溶于水，使得应用受到一定限制。目前，提取和纯化绿原酸的方法主要有溶剂提取法、微波/超声辅助提取法、超临界流体萃取法等提取方法和柱层析、大孔树脂吸附法和膜超滤法等纯化方法[5]。

绿原酸是烤烟烟叶中含量最高的多酚类物质，每年烤烟生产中会产生大量的废弃烟叶和烟杆等[6-7]，若能从中提取和纯化得到绿原酸等活性物质，会大大增加废弃烟叶的利用价值。该研究综述绿原酸的提取、纯化和检测方法与综合利用现状，以期为从废弃烟叶中获取纯度更高的绿原酸样品提供方法和理论支撑，也为烟叶中绿原酸的提取与综合应用提供参考。

1 烟草绿原酸的提取方法

1.1 有机溶剂提取法

绿原酸的极性较大，根据“相似相溶”的规律，可以利用丙酮、甲醇、乙醇等极性较强的有机溶剂提取。研究表明，选取67%的乙醇水溶液在61 ℃下可以较好地从废弃烟叶中提取绿原酸与芸香苷，2种化合物的理论提取量之和可达到43.59 mg/g[6]。将浸提温度升高到90 ℃，可以显著缩短浸提时间，废次烟叶中绿原酸的提取率可达0.714%[8]。增加浸提液中甲醇的比例，即使温度降低，提取时间缩短，烤烟中绿原酸的平均提取率也可达到90.38%[7]。也有研究表明，浸提剂中甲醇比例的增加尤其是当甲醇浓度超过80%后，绿原酸的提取率会显著下降[9]。

1.2 微波/超声波辅助提取法

微波/超声波辅助可以增加烟叶中绿原酸的提取效率[10]，超声辐照条件下，采用95%乙醇作为浸提剂，可以使得烟草中绿原酸的提取率达93.65%[11];采用氯化胆碱-苹果酸组成的深共熔溶剂体系作为提取溶剂，30 min的提取时间，绿原酸的提取量为（16.95±0.69） mg/g[12]。微波辅助提取技术在提取烟草废弃物中的绿原酸中也有应用，与传统的回流萃取相比，微波萃取提取率更高、时间更短。吴晓琼[13]以体积分数70%的乙醇水溶液为提取剂，在微波功率400 W和温度60 ℃下，萃取90 s，烟叶废弃物中绿原酸的提取率可达1.22%。

1.3 超临界流体提取法

超临界流体提取法能在较低温度下提取烟叶中的绿原酸，从而解决绿原酸热稳定性差、在较高提取温度下容易分解的问题，该方法将萃取和蒸馏分离合并，可以简化流程、节省能源消耗，提取的绿原酸纯度可以在90%以上，但是也存在设备昂贵和维护费用高等缺陷，目前绿原酸的超临界流体提取还没有大规模工业化应用[14]。

2 烟草绿原酸的分离纯化方法

2.1 膜分离法

超滤法是利用具有一定通透性的超滤膜，在压力作用下，将大分子蛋白、糖类等杂质分离出来的膜分离法，小分子物质可透过膜从而达到分离和纯化的目的。该方法具有操作简单、分离效率高、能耗低、无污染等优点，但也存在对提取液的预处理要求高、膜被污染后难以清洗的缺点，该方法的产量也受膜分离效率等的制约。研究对比了醇沉法和膜分离法对绿原酸的纯化效果，超滤法分离纯化后绿原酸的回收率可达99%，而用70%的醇沉法纯化绿原酸的回收率约为68%[15]。

2.2 柱层析法

柱层析法广泛应用于分离纯化烟草提取物中的绿原酸，该方法主要利用具有大孔结构的高分子树脂对烟草中绿原酸的吸附分离性能，通过洗脱溶液的共同作用，能够得到纯度较高的绿原酸。该方法具有操作简单、分离效率高、机械强度高、稳定性好和可再生等优点，缺点是耗时较长，使用后树脂清洗较困难。目前，广泛应用于绿原酸分离纯化的树脂主要有XDA-1树脂（吸附和解析效果俱佳，绿原酸总回收率可达80.06%）[11]、HPD-400大孔树脂（柱层析回收率72.30%）[16]和D101大孔树脂（动态回收率为70.37%）[17]等。

2.3 制备色谱法

现代制备色谱可以用于分离纯化出纯度较高（纯度>95%）的绿原酸产品，是绿原酸应用于医药领域不可缺少的分离手段[18]。制备色谱法具有分离速度快、选择性强、产品纯度好、自动化程度高的优点，但是也存在产量低、分离设备造价高昂、技术要求高、对操作人员的素质要求较高的缺点，目前该方法仅用于试验中制备高纯度的绿原酸。

3 烟草绿原酸的检测方法

目前，已见报道的绿原酸检测方法有极谱法[19]、薄层光密度法、紫外分光光度法、高效毛细管电泳法（HPCE）[20-21]、流动注射电致化学发光法、分子印记法、气相色谱法、高效液相色谱及其质谱联用法等。

3.1 液相色谱法

目前，涉及绿原酸含量的分析测试方法中，HPLC法的应用最为广泛，一般选取反相色谱柱分离烟草基质样品中的绿原酸，该方法测定绿原酸分离效果显著，方法的准确度和重复性都较好[22]，由于HPLC配备的检测器不同，其对绿原酸及其异构体的选择性还存在一定的局限性。基于此，2006年发布的烟草行业标准就选取HPLC法作为烟草及烟草制品中绿原酸的标准检测方法[23]。易小丽等[24]建立了烟叶中绿原酸及其异构体的HPLC-UV检测方法，选取甲醇-水溶液萃取烟叶中的绿原酸，采用反相C18色谱柱作为分离柱，外标标准曲线法进行定量分析，方法的检出限范围为0.013～0.028 mg/L，回收率在92.0%～104.0%。王晋等[25]采用UPLC法测定烟草中的绿原酸等8种多酚类化合物，方法的检出限为0.35～1.03 μg/g，样品分析时间为6 min，选取了一种集样品提取、固相萃取净化、过滤和转移为一体的样品萃取瓶，提升了样品处理效率。李力等[26]也选取UPLC法同时快速测定烤烟中的6种多酚，方法的检出限为3.7～9.9 μg/g，回收率为94.4%～106.8%，该方法的前处理简单，分析时间短，适合于烤烟中绿原酸等多种多酚含量的测定。由于绿原酸不稳定、易发生水解，在流动性中加入一定比例的乙酸或磷酸能够抑制绿原酸的羟基解离，有效改善目标色谱峰的拖尾现象。

3.2 液相色谱-串联质谱法

液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）是最为常用的复杂基质样品中痕量化合物的分析方法，该方法也广泛应用于烟草及烟草废弃物中绿原酸等多酚类物质的准确定量分析。王海燕等[27]采用HPLC-PDA-MS法对烟草中的多种多酚类化合物的定性分析，选取53%的甲醇作为提取剂，在微波作用下提取，该方法下总多酚得率为22.38 mg/g（干重）。LC-MS/MS还可以实现烟叶中10多种多酚类物质的同时定量测定，各目标化合物的检出限均低于200 ng/mL[28]。沈丹红等[29]采用HPLC-UV/MS同时测定烟叶中绿原酸等25种多酚类物质，各目标化合物的检出限均低于132 ng/mL，回收率为91.0%～112.4%。Ncube等[30]采用基于源内碰撞诱导解离的UPLC-QTOF-MS/MS法测定了烟草组织中的绿原酸和相关的肉桂酸代谢物，该方法可以检测解析绿原酸及其代谢物的异构体。

3.3 其他新检测方法

绿原酸的快速检测方法也是近年来的一个研究方向，基于分子印记聚合物的高选择性、压电石英晶体传感器的响应灵敏性能，吴灵等[31]研制出分子印记聚合物压电模拟生物传感器测定烟草中的绿原酸的方法，检出限达到2.5×10-8 mol/L，回收率为96.7%～105.0%，RSD为3.7%，该方法具有选择性好、线性范围宽、灵敏度高、准确度好等特点。