微波辅助酸水解褐藻糖胶的研究

摘要 [目的]研究微波辅助酸解在低分子量海带褐藻糖胶制备中的可行性。[方法]采用酸提取法制备海带褐藻糖胶，测定在不同HCl浓度（0、1、2 mol/L）、不同降解时间（40、50、60 min）、不同降解温度（70、80、90 ℃）条件下微波辅助酸解得到的褐藻糖胶的分子量，分析不同降解条件对褐藻糖胶分子量的影响，并与水浴辅助酸解的结果进行对比分析。[结果]随着HCl浓度、降解时间、降解温度的升高，酸解产物的分子量降低，且温度对降解产物分子量的影响最大。与水浴加热相比，微波辅助酸解降解产物的分子量更低。在80 ℃，HCl浓度为1 mol/L，降解40 min以上，比较容易制备低分子量褐藻糖胶。微波比水浴加热更容易对褐藻糖胶的硫酸基造成破坏。在2 mol/L HCl条件下，微波和水浴辅助酸解60 min，分别在70和90 ℃观察到明显的硫酸基脱除现象。[结论]采用微波辅助酸解法制备低分子量褐藻糖胶时，要注意硫酸基脱除的问题。

关键词 褐藻糖胶;酸解;微波辅助;分子量

中图分类号 TQ461  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2022）11-0154-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.11.040

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Study on Microwave-Assisted Acid Hydrolysis of Fucoidan

FENG Jin-hua1， LIU Hong-ying1， JIANG Shuai2 et al

（1. Ocean College of Hebei Agricultural University， Qinhuangdao，Hebei 066003;2. College of Fisheries and Life Science， Shanghai Ocean University， Shanghai 201306）

Abstract [Objective] To study the feasibility of microwave-assisted acidolysis in the preparation of low molecular weight kelp fucoidan. [Method]Kelp fucoidan was prepared by acid extraction. The molecular weight of fucoidan obtained by microwave-assisted acidolysis under different HCl concentration （0， 1， 2 mol/L）， different degradation time （40， 50， 60 min） and different degradation temperature （70， 80， 90 ℃）， was measured. The effects of different degradation conditions on the molecular weight of fucoidan were analyzed and compared with the results of water bath assisted acidolysis. [Result]With the increase of HCl concentration， degradation time and degradation temperature， the molecular weight of acid hydrolysis products decreased， and the temperature had the greatest influence on the molecular weight of degradation products.Compared with water bath heating， the molecular weight of microwave-assisted acid hydrolysis degradation products was lower. It was easy to prepare low molecular weight fucoidan at 80 ℃， HCl concentration of 1 mol/L and degradation for more than 40 min. Microwave was easier to destroy the sulfate group of fucoidan than water bath heating. Under the condition of 2 mol/L HCl， microwave and water bath assisted acidolysis for 60 min， obvious sulfate removal was observed at 70 ℃and 90 ℃ respectively. [Conclusion]When preparing low molecular weight fucoidan by microwave-assisted acidolysis， attention should be paid to the removal of sulfate group.

Key words Fucoidan;Acidolysis;Microwave-assisted;Molecular weight

褐藻糖胶是来自海洋褐藻的一种含硫酸酯的水溶性多糖，单糖组成主要为岩藻糖，所以又被称为岩藻聚糖硫酸酯[1]。除褐藻外，岩藻聚糖硫酸酯在无脊椎动物如海参中也存在[2-3]。褐藻糖胶已被证实是一种具有多种功能的多糖，如具有明显的抗氧化[1，4]、抗凝血[5]、免疫调节[6]、抗肿瘤[7-8]、抗病毒[9]、抗辐射[10]等功能。褐藻糖胶在日本、美国作为预防和治疗癌症及血栓疾病的药物已进入市场。在中国，研究发现褐藻糖胶治疗肾衰有一定作用，开发出海昆肾喜胶囊，已获得新药证书。褐藻糖胶对于单纯孢疹病毒、艾滋病病毒、烟草花叶病毒等病毒均有一定的抑制作用，加上褐藻糖胶具有明显的抗氧化活性及免疫调节活性，在治疗新冠肺炎感染上也可能具有一定的应用潜力。所以褐藻糖胶的研究有较大的应用前景和市场潜力。

褐藻糖胶的功效与其独特的多糖结构和相对分子质量有一定的关系。有研究认为，褐藻糖胶的分子量大小可以影响多糖的吸收效果，且吸收效率大致与分子量成反比[9]，低分子量褐藻糖胶在很多情况下表现出比大分子量较好的生物活性[11-12]，且低分子量褐藻糖胶具有黏度低、易吸收、生物利用率好等优点。所以低分子量褐藻糖胶也是目前的一个研究热点。

现在应用于制备低分子量褐藻糖胶的方法主要有酶降解法[13]、酸降解法[14]、H2O2降解法[15]和超声波降解法[16]等。物理方法辅助降解多糖已有很多报道，常用的为紫外线、γ射线、微波辐射等。与传统加热相比，发现微波辐射可以提高降解速率，改善反应条件，大大减少了反应时间，有利于节约能源。采用微波辅助降解褐藻糖胶，目前研究还比较少。笔者就微波辅助褐藻糖胶酸降解进行研究，通过比较在不同降解条件下微波辅助和水浴辅助盐酸降解褐藻糖胶所得降解产物的分子量和结构，探讨微波辅助酸降解在低分子量褐藻糖胶制备中应用的可行性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原材料。干海带，购买于河北省黄骅市市场。

1.1.2 主要仪器。FM100型高速万能粉碎机，由天津市泰斯特仪器有限公司生产;HH-8型恒温水浴锅，由江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司生产;H185OR型台式高速冷冻离心机，由湖南湘仪实验室仪器开发有限公司生产;D2F-6050AB型电热真空干燥箱，由天津工兴实验室仪器有限公司生产;WGH-30A型双光束红外分光光度计，由天津港东科技发展股份有限公司生产;MDS-8G型微波消解仪，由上海新仪微波化学科技有限公司生产;78HW-1型恒温磁力搅拌器，由江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司生产;FA2104N型精密分析电子天平，由上海菁海仪器有限公司生产;Scout SE型电子天平，由梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司生产;DF-4型压片机，由天津港东科技发展股份有限公司生产;Agilent 1260型高效液相色谱仪，由美国安捷伦公司生产;示差检测器，由美国安捷伦公司生产;TSK G4000-PWXL和 TSK G3000-PWXL凝胶色谱柱，由日本TOSOH公司生产。

1.1.3 主要试剂。葡聚糖标准品，分子量 410 000、270 000、25 000、12 000、5 000和1 000 Da，由美国Sigma公司生产;溴化钾（AR），由天津天光光学仪器有限公司生产;盐酸（AR），由上海环发化工有限公司生产。

1.2 试验方法

1.2.1 褐藻糖胶的提取与纯化。海带清洗风干后粉碎至粉状，200 g海带粉中加入2 L 0.17 mol/L的盐酸溶液搅拌均匀。在70 ℃水浴锅中水浴1 h，离心后吸取上清液保留备用，沉淀再次用盐酸提取，重复3次，合并上清液，用NaOH调pH到中性，加热蒸发样品至1 250 mL，室温冷却后加540 mL无水乙醇（使无水乙醇体积分数为30%），保鲜膜封口静置过夜，离心去沉淀，继续加无水乙醇，使无水乙醇体积分数达到60%，离心取沉淀，干燥得褐藻糖胶粗品，干燥器中保存，备用。重复此酸提取过程，大量制备褐藻糖胶粗品，称重，贮存备用。

将褐藻糖胶粗品溶于蒸馏水中，加入无水乙醇至20%，离心去沉淀（除去溶解的褐藻酸和色素杂质），上清液再加入无水乙醇至其体积分数为60%，将褐藻糖胶沉淀出来，最后对沉淀物按0.886 g和9 mL水的比例溶解，加乙醇至30%，看是否有沉淀生成，如果离心后有沉淀，继续加入无水乙醇至体积分数为70%，使褐藻糖胶呈半胶体状态，按0.1 g NaCl/1 mL水的比例加入氯化钠使半胶体物质迅速絮凝，离心干燥得到呈褐色的砂状褐藻糖胶纯品。将褐藻糖胶纯品用水溶解，透析2 d，然后在透析后的褐藻糖胶溶液中加入无水乙醇使乙醇浓度为80%，密封静置一夜，离心，收集沉淀，60 ℃烘干，得到焦黄色褐藻糖胶块状儿纯品，称其质量，贮存备用[17]。

1.2.2 褐藻糖胶的降解。采用盐酸进行褐藻糖胶的降解。配制0.5%褐藻糖胶水溶液，并加入不同体积的浓盐酸使溶液呈酸性，进行水浴和微波辅助降解。降解条件分别为HCl浓度0、1、2 mol/L，降解时间40、50、60 min，降解温度70、80、90 ℃。

反应结束冷却至室温，将样品用NaOH中和至pH 7.0，并加入3倍乙醇，醇沉过夜，离心收集沉淀样品，干燥后称重，储存备用。

1.2.3 褐藻糖胶分子量表征。采用高效凝胶排阻色谱方法对褐藻糖胶原样及降解后的褐藻糖胶各样品进行分子量的检测[18]。

具体分析条件如下：色谱柱为TSK G4000-PWXL和TSK G3000-PWXL;流动相为0.2 mol/L醋酸/0.1 mol/L醋酸钠溶液;流速1 mL/min;柱温30 ℃;检测器为示差检测器。样品浓度为0.4%（ W/V ）。采用不同分子量的葡聚糖（410 000、270 000、25 000、12 000、5 000和1 000 Da）对凝胶色谱柱进行校准。

1.2.4 褐藻糖胶样品红外光谱分析（FT-IR）。采用KBr压片法，在WGH-30A型双光束红外分光光度计上对褐藻糖胶原样及降解后的褐藻糖胶样品进行分析，波长扫描范围4 000～400 cm-1，记录红外光谱图并分析。

2 结果与分析

2.1 褐藻糖胶的提取

4 000 g海带干粉共制备褐藻糖胶粗品78 g，产率为1.95%。粗品进一步经乙醇分级纯化、透析后，共得到褐藻糖胶纯品16 g，纯品产率为0.4%。

经检测，褐藻糖胶纯品平均相对分子量为2.660×105 Da。张全斌等[1]采用水提法制备的海带褐藻糖胶的平均分子量为10.890×105 Da。徐祖洪等[19]研究的从海带中制备褐藻糖胶的方法，得率为0.20%～0.35%，与该试验的研究结果相近。