刺梨果多糖提取过程中脱蛋白和脱色方法研究

摘要 [目的]筛选出梨果粗多糖水提醇沉过程中最佳的蛋白质和色素的脱除方法。[方法]以蛋白质脱除率、多糖保留率以及数据加权平均法构成的综合评分为评价指标，选用三氯乙酸法、三氯乙酸-Sevage法、三氯乙酸-正丁醇法、Sevage法、木瓜蛋白酶法、木瓜蛋白酶-Sevage法、木瓜蛋白酶-三氯乙酸法、木瓜蛋白酶-三氯乙酸-正丁醇法和盐酸法9种脱蛋白方法对刺梨果粗多糖水提物的脱蛋白效果进行对比;同时在单因素试验的基础上，通过正交试验优化三氯乙酸-正丁醇法对刺梨果粗多糖水提物的脱蛋白工艺条件。并以脱色率和多糖保留率为评价指标，比较过氧化氢溶液与活性炭粉末对刺梨果多糖水提物的脱色效果。[结果]三氯乙酸-正丁醇法脱蛋白效果最佳，三氯乙酸-正丁醇法脱蛋白的最佳工艺条件为样液与试剂体积比为1∶2、三氯乙酸与正丁醇体积比为1∶10、振荡时间为60 min，此时脱蛋白率为78.64%，多糖保留率为86.59%。活性炭粉末对刺梨果粗多糖的脱色素和多糖保留率均优于过氧化氢溶液。[结论]该试验优选出的方法具有实际可操作性，可有效脱除刺梨果粗多糖中的蛋白质和色素，最终确定三氯乙酸-正丁醇法和活性炭粉末作为刺梨果多糖初步纯化方法，为进一步研究多糖的色谱分析、结构鉴定、构效关系和生物活性研发提供数据支持。

关键词 刺梨;多糖;提取;脱蛋白;脱色方法;脱色素;活性炭

中图分类号 TQ281  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2022）11-0162-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.11.042

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Study on the Method of Deproteinization and Decolorization in the Process of Extracting Polysaccharides from  Rosa roxburghii  Fruit

LI Qian-qian1，CHEN Gui-yuan1，2

（1. School of Basic Medical Sciences， Dali University， Dali， Yunnan 671000; 2. Key Laboratory of Insect Biomedicine Research and Development of Yunnan Province， Dali，Yunnan 671000）

Abstract [Objective]To screen out the best method for removing protein pigment in the process of water extraction alcohol precipitation of  Rosa roxburghii  fruit crude polysaccharide.[Method]Taking protein removal rate， polysaccharide retention rate and data weighted average method as the evaluation index， 9 kinds of deproteinization methods（trichloroacetic acid method， trichloroacetic acid-Sevage method， trichloroacetic acid-n-butanol method， Sevage method， papain method， papain-Sevage method， papain-trichloroacetic acid method， papain-trichloroacetic acid-n-butanol method hydrochloric acid method） were selected to compare the deproteinization effects of crude polysaccharide water extracts from  Rosa roxburghii  fruit.At the same time， on the basis of single factor experiment， orthogonal experiment was used to optimize the deproteinization process conditions of the water extract of  Rosa roxburghii  fruit crude polysaccharide by trichloroacetic acid-n-butanol method. And the decolorization rate and polysaccharide retention rate were used as evaluation indicators to compare the decolorization effect of hydrogen peroxide solution and activated carbon powder on the water extract of prickly pear fruit polysaccharide.[Result]The deproteinization effect of the trichloroacetic acid-n-butanol method was the best，the best process conditions for the deproteinization of the trichloroacetic acid-n-butanol method were that the volume ratio of sample solution to reagent was 1∶2， the volume ratio of trichloroacetic acid to n-butanol was 1∶10， and the shaking time was 60 min.At this time， the deproteinization rate was 78.64%， the polysaccharide retention rate was 86.59%.The powdered activated carbon had better depigmentation polysaccharide retention rate of the crude polysaccharides from  Rosa roxburghii  fruit than the hydrogen peroxide solution. [Conclusion]The method selected in this test has practical operability， and can effectively remove the protein and pigment in the crude polysaccharide of  Rosa roxburghii  fruit. Finally， the trichloroacetic acid-n-butanol method and activated carbon powder are determined as the preliminary purification method of  Rosa roxburghii  fruit polysaccharide，which provides data support for further research on chromatographic analysis， structure identification， structure-activity relationship and biological activity research and development of polysaccharides.

Key words  Rosa roxburghii; Polysaccharide;Extraction;Deproteinization;Decolorization method;Depigmentation;Activated carbon

刺梨 （Rosa roxburghii  Tratt.，RRT），又名送春归，为蔷薇科蔷薇属多年生落叶小灌木，广泛分布于云贵高原及攀西高原，是我国营养价值较高的野生资源之一。刺梨作为具有地域特色的药食同源植物，最早文学记载于公元1640年的《黔书》，随后《贵州通志》《黔滇记游》《本草便方二亨集》等也对刺梨的产地、种植栽培技术及植物形态等进行了详细描述[1]。刺梨的药用价值最早见于古代医学典籍《本草纲目拾遗》，书中详细记录了刺梨的根、 茎、 花、 叶、果实不同的治疗功效，其独特的药理作用引起众多学者的广泛关注[2]。现代药理学研究发现，刺梨含有丰富的多糖[3]、黄酮[4]、单宁[5]、有机酸[6]、抗坏血酸[7]、三萜类[8]、SOD[9]、β-谷甾醇[10]、 氨基酸[11]及微量元素[12]等生物活性物质。刺梨可溶性多糖含量为8.62%～10.52%（以鲜果重计）[13]，刺梨多糖 （Rosa roxburghii  Tratt. polysaccharide，RRTP）不仅作为生物体的结构成分和体内主要的供能和储能物质，而且广泛参加机体的各项生命活动，具有免疫调节[14]、抗氧化[15]、调节肠道菌群结构[16]、降血糖[17]和降血脂[18]等功效，至此多糖已成为现代医学和医药保健领域关注的焦点，但是刺梨果多糖水提物中含有色素、蛋白质、单糖、寡糖、无机盐及有机杂质，不仅影响多糖的初步分离鉴定、后续纯化、结构表征，而且对具体功效的研发带来很大障碍。因此在保证多糖结构和生物学活性的前提下，寻求一种脱色水平高、除蛋白效果好的脱色和脱蛋白工艺技术对食品研究与开发至关重要。

目前，植物多糖传统的脱蛋白方法有Sevage法[19]、三氯乙酸法[20]、酶法[21]等，新型的脱蛋白方法如FTT法[22]、DAC法[23]、MCM法[24]、CaCl2法[25]和树脂吸附法[26]等，也有将2种或者2种以上方法联用来进行脱蛋白，称为联用法[27]。脱色方法主要有活性炭法[28]、过氧化氢溶液法[29]、柱层析法[30]和反胶束法[31]等。其中活性炭（activated carbon，AC）内部孔隙结构发达，具有比表面积大、吸附强、过滤快、脱色纯度高的优势，并且价格合理、无毒无味，从而广泛应用于环保、食品、冶金、化工等各领域。当活性炭法脱色作用不明显时， 需考虑用过氧化氢法脱色。过氧化氢（H2O2）是一种强氧化剂，过氧化氢的漂白作用需要在介质水中电解成H+和HO2-，产生氧气和氢氧化钠，过氧化钠同样具有氧化性。多糖液中， 色素被游离的HO2-氧化而达到脱色素的目的。基于此，该研究以刺梨果多糖水提物为原料，采用三氯乙酸法、三氯乙酸-Sevage法、三氯乙酸-正丁醇法、Sevage法、木瓜蛋白酶法、木瓜蛋白酶 + Sevage法、木瓜蛋白酶 + 三氯乙酸法、木瓜蛋白酶-三氯乙酸-正丁醇法、盐酸法对其进行脱蛋白比较，选择粉末状的活性炭和30%过氧化氢溶液对多糖溶液进行脱色，寻求最佳的脱蛋白和脱色工艺参数，为进一步分离纯化刺梨果多糖提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试材与试剂 刺梨果，购自贵州省遵义市产品，购于2020年11月。牛血清白蛋白，上海如吉生物科技有限公司;木瓜蛋白酶（活性≥60万单位/g，批号325A027），北京索莱宝科技有限公司;考马斯亮蓝G-250，碧云天生物技术有限公司;活性炭，上海琪特分析仪器有限公司;D-无水葡萄糖（含量≥99%，批号110833-201506），中国食品药品检定研究院;三氯乙酸、盐酸、正丁醇、30%过氧化氢溶液、氯仿、磷酸氢二钠、柠檬酸、氯化钠、无水乙醇、98%浓硫酸溶液、蒽酮、葡萄糖，天津福晨化学试剂厂，均为分析纯。

1.2 仪器与设备 SHA-C恒温水浴锅，金坛区杰瑞尔电器有限公司;BT-224S型电子分析天平，北京赛多利斯仪器有限公司;RE-3000型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂;754紫外可见光分光光度计，上海菁华科学仪器有限公司;TGL-16B高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂;SJ-3恒温磁力搅拌器，常州智博仪器制造有限公司;RXH-5-C远红外节能鼓风循环式不锈钢烘箱，上海市崇明实验仪器厂;FD-1型冷冻干燥箱，北京博医康技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 刺梨果粗多糖的制备[32]。刺梨干果→烘干→粉碎→脱脂→热水浸提→离心→真空浓缩→醇沉→冷冻干燥→刺梨果粗多糖（RTFP）。

1.3.2 刺梨果多糖保留率的测定。采用蒽酮-浓硫酸法[33]测定刺梨果多糖的含量。以葡萄糖标准溶液浓度（mg/mL）为横坐标，于620 nm处测得的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程为 Y=1.657 9X+0.014 1（R2=0.999 4）， 表明葡萄糖溶液质量浓度在0～0.6 mg/mL与吸光度呈现良好的线性关系。

多糖保留率的计算公式如下：

C=c2c1 ×100%（1）

式中， C为多糖保留率（%）;c1 为脱蛋白（脱色素）前刺梨果多糖的质量浓度（mg/mL）; c2 为脱蛋白（脱色素）后刺梨果多糖的质量浓度（mg/mL）。

1.3.3 刺梨果多糖脱蛋白率的测定。采用考马斯亮蓝G-250法[34]测定蛋白质含量。以牛血清白蛋白标准品含量（μg/mL）为横坐标，于595 nm处测得的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程 为y=0.055 5x+0.010 1（R2 =0.997 4），表明葡萄糖溶液质量浓度在0～6 μg/mL与吸光度呈现良好的线性关系。