黄豆·红豆不同配比发酵对大豆异黄酮成分的影响

摘要[目的]探讨红豆、黄豆不同配比混合后发酵4种大豆异黄酮成分含量差异。[方法]将红豆与黄豆按3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3混合接种枯草芽孢杆菌菌种，高效液相色谱法测定样品大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素含量。[结果]混合后发酵样品中以1∶1配比时苷元类（大豆苷元+染料木素）含量最高，比1∶2时提高了15.35%，比1∶3时提高了26.40%;与发酵后混合样品相比较，比相同配比1∶1时提高了17.88%。[结论]红豆、黄豆不同配比混合后发酵4种大豆异黄酮成分含量存在差异，以红豆、黄豆1∶1为最佳配比，此时具有活性的苷元含量最高。

关键词红豆;纳豆;大豆异黄酮;高效液相色谱法

中图分类号TS201.3文献标识码A

文章编号0517-6611（2022）13-0166-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.13.044开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Determination of 4 Kinds of Soy Isoflavones in Different Ratios of Soybean and Red Bean Fermentation

CAO Yang REN Rong WU Tian-yuan et al（1.Heilongjiang Academy of Traditional Chinese Medicine，Harbin，Heilongjiang 150036;2.Chengyang District People’s Hospital in Qingdao City，Qingdao，Shandong 266000;3.School of Pharmacy，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin， Heilongjiang 150040）

Abstract[Objective]In order to explore the difference of the content of four kinds of soy isoflavones fermented by soybeans and red beans mixed with different ratios.[Method] By bacillus subtilis strains， red beans and soybeans were fermented after mixture and mixed after fermentation at ratios of 3∶1， 2∶1， 1∶1， 1∶2， 1∶3.The  contents of Daidzein， Genistein， Daidzein， Genistein were quantitatively analyzed by external standard method.[Result]After mixing， the aglycon content was the highest when the ratio was 1∶1， which was 15.35% higher than that of 1∶2， and 26.40% higher than that of 1∶3;compared with the post-mixed samples，it is 17.88% higher than the same ratio of 1∶1.[Conclusion]There were differences in the content of fermented isoflavones in the four soybean isoflavones after mixing with different ratios of red beans and soybeans.The best ratio of red beans and soybeans was 1∶1， and the active aglycon content was the highest at this time.

Key wordsRed beans;Natto;Soy isoflavones;High performance liquid chromatography

纳豆（Natto），起源于古代的豆豉，主要由黄豆经枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）发酵而成。由于含有黄酮类等多种生物活性成分，同时具备降血脂、溶栓、调整胃肠、预防骨质疏松等功效，现已被广泛食用。近年来，利用不同豆类作为底物对纳豆进行改良的研究报道较多，其中红豆是一种具有健脾益肾、养心补血、清热解毒、利尿消肿等功效的药食同源豆类食物，含有多酚、皂苷等活性成分[1]。国内有学者以单纯红豆为底物对纳豆发酵工艺、性状、品质及总黄酮、总游离氨基酸含量进行了研究，但尚缺乏以黄豆、红豆按照不同配比进行发酵制作纳豆的研究。笔者采用高效液相色谱法测定样品中大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素4种大豆异黄酮含量，考察红豆、黄豆不同配比发酵后异黄酮含量差异。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1原材料。中龙2号小粒黄豆：黑龙江省中医药科学院实验室提供;红豆：市售。

1.1.2菌种。枯草芽孢杆菌（CICC 20640），中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.1.3试剂。染料木苷（R-002-150802，HPLC>98%）、染料木素（R-001-150421，HPLC>98%）、大豆苷（D-013-150928，HPLC>98%）、大豆苷元（D-016-150423，HPLC>98%）：成都瑞芬思生物科技有限公司;甲醇、乙腈（色谱纯）：美国Chroma Dex公司。

1.1.4仪器。Waters 2695型高效液相色谱仪，立式压力蒸汽灭菌器，BSC-1360型生物安全柜，DHP 9272 型恒温培养箱。

1.2方法

1.2.1菌株扩繁。吸取菌液至培养基中进行扩繁培养，180 r/min下37  ℃摇瓶培养72 h，用菌落计数仪测定菌液浓度后用培养液调配成含菌量为1×10⁶个，4 ℃冷藏，备用。

1.2.2样品制备。参考文献[2]，分别称取适量的中龙2号小粒黄豆、红豆，加适量水浸泡过夜，按红豆∶黄豆比例为3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3混合100 g分别装入三角瓶中，121 ℃灭菌30 min。冷却后，按0.33 mL/瓶接种菌液，摇匀，37 ℃发酵24 h，取出置于4 ℃冰箱中后熟24 h，取出后置于-80 ℃冰箱备用。

1.2.3样品中大豆异黄酮含量测定。

1.2.3.1色谱条件。色谱柱Symmetry®-C18 （4.6 mm×150 mm，5 μm ）;流动相：A相（甲醇）-B相（0.5%乙酸水），梯度洗脱：0～2 min  5%A相，2～13 min 5%～30%A相，13～40 min 30%～60%A相;检测波长254 nm;流速1.0 mL/min;柱温40 ℃;进样量10 μL。

1.2.3.2标准溶液制备。精密称取4种对照品配成混合标准品溶液，其中大豆苷浓度为0.206 mg/mL，大豆苷元浓度为0.195 mg/mL，染料木苷浓度为0.208 mg/mL，染料木素浓度为0.199 mg/mL。

1.2.3.3样品前处理。分别精密称取样品各2 g，研磨后加入适量70%乙醇，超声提取60 min后，用70%乙醇定容至25 mL，8 000 r/min离心15 min，取上清液，过0.45 μm微孔滤膜，备用。

2结果与分析

2.1标准品和样品色谱图从图1可见，4个峰完全分离（分离度R>1.5），基线平稳，分析时间为45 min。

2.24种异黄酮的含量将红豆、黄豆按照不同配比混合发酵后，测定4种异黄酮的含量， 结果见表1。由表1可知，与单纯用红豆发酵相比，单纯用黄豆发酵样品中大豆苷元和染料木素含量较高;红豆与黄豆按照不同配比发酵样品中，以配比为1∶1的样品中大豆苷元和染料木素的含量最高，随着黄豆配比量的增加，大豆苷元和染料木素的含量反而降低，且均高于红豆单纯发酵，低于黄豆单纯发酵。

将单纯用黄豆、红豆发酵的样品按照不同配比混合后，置于4 ℃冰箱中后熟，测定4种大豆异黄酮的含量变化，结果见表2。由表2可知，将单纯发酵样品按不同配比混合后后熟的样品中，以配比为1∶3的样品中大豆苷元和染料木素的含量最高，均高于单纯的红豆发酵，但低于单纯黄豆发酵样品。综合表1、2可知，发酵对大豆异黄酮含量影响较大，例如将红豆与黄豆混合发酵，并非黄豆的含量越多越好，而是按照1∶1配比时大豆苷元+染料木素含量最高，比1∶2配比提高了15.35%，比1∶3时提高了26.40%;与发酵混合样品相比较，比相同配比1∶1时提高了17.88%。

3讨论

红豆为豆科植物红小豆或红豆的种子，李时珍《本草纲目》中记载，红豆性平，味甘、酸，归心、小肠经，除可食用外还具有利水消肿、补脾养胃、补益气血、清热解毒等药用价值和保健作用，应用历史较为悠久[3]。尤其是对于女性来说，红豆含有极其丰富的膳食纤维，可以促进人体胃肠蠕动，加快肠道垃圾的排出，具有润肠通便的作用[4];含有矿物质钾具有利水消肿瘦身的功效，有利于水肿型肥胖和体内湿气过重的人群[5]。同时，红豆不仅富含铁质，还含丰富的VB1、VB2、VB6、叶酸、烟酸等B族维生素，具有美容养颜、补益气血、养心安神的功效，经常食用红豆制品，可以调理气血，使面部红润。纳豆由于制备工艺简单，是保健功能较多的大豆发酵食品，逐渐被国内人群所食用[6-7]。大豆异黄酮[8]是一种主要存在于豆类中的植物性雌激素，具有延缓女性细胞衰老，预防骨质疏松，与骨细胞上的雌激素受体结合，可减少骨质流失，促进机体对钙的吸收[9-10]。因此，进入更年期的女性更应该食用发酵豆类产品。宋军霞[11]通过对比研究不同豆类发酵样品，发现红豆发酵后的纳豆具有粗壮黏丝，整体颜色为暗红色，其中黏多糖、氨基酸含量较其他豆类发酵品高，且稍有氨味，发酵效果较好。王琳等[12]考察了单纯采用红豆发酵纳豆的工艺，以纳豆激酶的酶活力对接种量、种龄、发酵时间进行优化，得到具有纳豆香味，色泽诱人的红豆纳豆，但是并未对纳豆中的异黄酮类成分进行考察。该试验单纯采用红豆进行发酵时，发现大豆异黄酮含量偏低。因此，以大豆异黄酮作为指标，将红豆和黄豆进行配比，期望得到一种既含有较高异黄酮含量，又具有红豆特性的新型纳豆产品。

该试验通过黄豆与红豆的不同配比，经发酵后测定大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素含量。结果表明，混合后发酵对大豆异黄酮含量影响较大，按照1∶1配比时大豆苷元+染料木素含量最高，且随着黄豆含量增加而降低，大豆苷元+染料木素含量比1∶2时提高了15.35%，比1∶3时提高了2640%;与发酵后混合样品相比较，大豆苷元染料木素含量比相同配比1∶1时提高了17.88%。该试验可初步确定红豆与黄豆混合发酵的配比为1∶1，为进一步考察添加红豆的新型纳豆产品奠定了理论基础，但混合发酵后大豆异黄酮的含量并不随黄豆的量增加而增加，相关机制有待进一步研究。

参考文献

[1] 赵非一.豆家族中的红豆、黄豆、黑豆：专家评点它们的营养绝活[J].自我保健，2017（4）：19.

[2] 张树明，夏宇琦，曹阳.黄豆、黑豆混合后发酵与发酵后混合大豆异黄酮含量的对比研究[J].中国中医药科技，2019，26（4）：538-540，649.

[3] 李叶.女性养生药膳大全[M].北京：北京联合出版公司，2014.

[4] 唐之枫，刘帅.长夏湿热当令，祛湿健脾为先——薏米红豆[J].中老年保健，2016（8）：40-41.

[5] 仲年.中年肥胖者应常食红豆[J].家庭科学，2019（7）：62.

[6] 聂冰秀，顾悦，张承泰，等.纳豆的保健功效及应用前景[J].粮食加工，2021，46（1）：69-72.

[7] 韩瑞超，相雪，谭璐佳，等.纳豆压片糖果的研究[J].安徽农业科学，2015，43（28）：275-277.

[8] 任维利.大豆异黄酮的作用研究进展[J].食品安全导刊，2021（14）：74-75.

[9] 王宁涛，黄争美，张志愿，等.大豆异黄酮抗骨质疏松作用的研究进展[J].中华实验外科杂志，2018，35（1）：176-178.

[10] 陈嘉序，陈如扬，连媛，等.大豆异黄酮的生物转化及功能活性研究进展[J].食品研究与开发，2021，42（9）：176-182.

[11] 宋军霞.常见豆类制备纳豆的品质比较[J].大豆科学，2017，36（2）：309-314.

[12] 王琳，高辰哲，刘丹怡，等.响应面法优化红豆纳豆的发酵工艺[J].中国酿造，2018，37（1）：190-194.