宁夏野生甘草和种植甘草内生菌的分离和初鉴定

摘要[目的]对宁夏盐池野生甘草和种植甘草根部内生菌进行分离纯化，比较野生和种植甘草中内生菌的特点。[方法]通过组织块法，分别在牛肉膏蛋白胨培养基中分离纯化内生细菌，在土豆琼脂培养基中分离纯化内生真菌;将获得的单一菌株通过菌落形态观察、显微镜观察进行形态学鉴别。[结果]野生甘草样本最终获得8株内生真菌（Yfr01～Yfr08），分属青霉属Penicillium、根霉属Rhizopus、木霉属 Trichoderma、镰孢属 Fusarium，4株甘草内生细菌（Ybr01～Ybr04）均属于芽孢杆菌属Bacillus。从种植甘草样本中最终获得2株甘草内生真菌（Zfr01～Zfr02），分属根霉属Rhizopus 和镰孢属 Fusarium，2株甘草内生细菌（Zbr01～Zbr02）均属于芽孢杆菌属Bacillus。[结论]野生甘草中内生菌无论是数量还是多样性都明显高于种植甘草，试验结果为后续产甘草有效成分菌株的筛选提供基础。

关键词甘草;内生菌;分离纯化;菌属鉴定

中图分类号R284文献标识码A

文章编号0517-6611（2022）13-0169-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.13.045

Isolation and Preliminary Identification of Endophyte of Wild and Cultivated Glyeyrrhica uralensis in Ningxia

ZHANG Ran LI Jia

（1. Ningxia Polytechnic， Yinchuan， Ningxia 750021; 2.Alashan League Ecological Environment Comprehensive Service Center， Alashan League，Inner Mongolia 750300）

Abstract[Objective]To isolate and purify the endophytic bacteria in the roots of wild licorice and cultivated Glyeyrrhica uralensis in Yanchi， Ningxia， and compare the characteristics of endophytic bacteria in wild and cultivated Glyeyrrhica uralensis. [Method]Endophytic bacteria were isolated and purified in beef extract peptone medium and endophytic fungi were isolated and purified in potato agar medium; the single strain was identified by colony morphology and microscope. [Result]8 strains of endophytic fungi （Yfr01-Yfr08） were finally obtained from wild Glyeyrrhica uralensis samples， which belonged to Penicillium， Rhizopus， Trichoderma and Fusarium， and 4 strains of endophytic bacteria （Ybr01-Ybr04） belonged to Bacillus.Two strains of endophytic fungi of Glyeyrrhica uralensis  （Zfr01-Zfr02） were finally obtained from the samples of cultivated Glycyrrhiza， which belong to Rhizopus and Fusarium， and two strains of endophytic bacteria of Glyeyrrhica uralensis （Zbr01-Zbr02） belong to Bacillus. [Conclusion]The number and diversity of endophytic bacteria in wild Glyeyrrhica uralensis were significantly higher than those in planting Glyeyrrhica uralensis. The experimental results will provide a basis for the subsequent screening of strains producing effective components of Glyeyrrhica uralensis.

Key wordsGlyeyrrhica uralensis;Endophyte;Isolation and purification;Genus identification

甘草（Glyeyrrhica uralensis），豆科甘草属灌木状多年生草本植物，是我国干旱、半干旱地区重要的植物资源，宁夏、甘肃、内蒙古等地为其主产区，具有耐旱、耐盐碱、防风固沙等特点[1]，可以产生较好的生态效益。同时甘草作为我国重要的大宗药材，具有补脾益气、清热解毒、 祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药、抗癌抗病毒等作用，在临床上用于治疗呼吸系统、消化系统、免疫系统等疾病[2]。此外，甘草还广泛应用于食品[3]、化工等工业中。因此，优质甘草在国内外需求量极大，市场供不应求。随着近年来对于野生甘草资源毫无节制的采挖，资源总量和质量逐年下降，野生甘草资源已接近枯竭。而人工栽培甘草的周期长、难度大，且药用成分如甘草黄酮、甘草酸等含量都较低。因此探索如何提高人工种植甘草质量则成为间接保护野生甘草资源、保障甘草市场需求的方法之一。

植物内生菌是指一类共生于植物体内，而不使宿主植物表现出明显感染症状或产生负向影响的微生物[4]。药用植物中也含有大量的内生菌，研究表明一些内生菌可与药用植物进行基因融合，使其具有可以合成与宿主相同药效物质的能力;有些内生菌也可协助植物共同完成一些生物的合成，使中药材中药用成分含量增加[5]。甘草中也有非常丰富的内生菌资源，其中以从根中分离的菌株为主。从野生优质甘草中分离其内生菌，并摸清内生菌和甘草间的相互作用、内生菌和甘草药用成分间的关系，都将为提高种植甘草的药用品质提供新思路，同时也将为野生甘草的保护、解决其资源匮乏等问题提供新途径。

1材料与方法

1.1材试验料

1.1.1试材。试验用种植甘草植株采自宁夏盐池甘草种植基地，试验用野生甘草植株采自宁夏盐池金马村，并由宁夏中药材研究中心郭红艳教授鉴定为乌拉尔甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）。

1.1.2培养基。

1.1.2.1牛肉膏蛋白胨（BPDA）培养基。牛肉膏 3 g、蛋白胨 10 g、氯化钠5 g，加蒸馏水热搅拌至全部溶解后，加入琼脂 20 g，调 节 pH 至 7.3～7.6，补加蒸馏水定容至 1 000 mL，高压蒸汽灭菌后倒平板，每个培养皿约 15 mL，放置冷却凝固，无菌观察，备用。

1.1.2.2马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）。将马铃薯去皮，取 200 g，切成小块放入加 1 L 水中，加热煮沸 30 min，用四层纱布过滤，加入 20 g 葡萄糖、5 g氯化钠、20 g 琼脂，溶液再加热煮至琼脂全部溶解，补加蒸馏水定容至 1 000 mL，调 节 pH 至 7.0～7.4，高压蒸汽灭菌后，加适量氯霉素倒平板，每个培养皿约 15 mL，放置冷却凝固，无菌观察，备用。

1.2试验方法

1.2.1甘草处理。2种甘草样本各取一截根部外表无破损的部分，约5 cm，用自来水将甘草表面泥土冲洗干净，放入超净工作台紫外照射杀菌30 min，之后用75%乙醇浸泡1 min，无菌水冲洗5次;3%次氯酸钠浸泡2 min，无菌水冲洗5次;75%乙醇浸泡1 min，无菌水冲洗5次。

1.2.2内生菌分离培养。以无菌滤纸片吸干甘草样品表面水分并剥去甘草根部外皮，再用灭菌的手术剪刀将样品沿甘草根部横截面剪切成2～3 mm厚的薄片，接种于已制备好的2种固体培养基上，每个培养皿中接3～4块，并标记好，每个样本 10皿。将接种植株组织的培养基用封口膜封好，放置于智能光照培养箱培养，28 ℃恒温培养，BPDA培养基培养2～3 d，PDA培养基培养3～5 d。同时设置空白对照组，即将剥去外皮的甘草根部组织块在空白的培养基上滚动并轻轻按压，使样品表面各处都接触到培养基，再用封口膜封口，与接种好的培养皿在相同条件下一起培养，若对照组培养皿上未长出菌落，说明植株的表面消毒彻底[6]。培养完成后，分别计算2种甘草的分离率和定殖率，其中分离率为从样本组织块中得到的菌株数与全部样本组织块数的比值，定殖率为样本中受内生真菌侵染的组织块数占全部样本组织块数的百分数。

1.2.3内生菌的纯化。培养完成后，观察2种培养基的空白对照组和样品组，若空白对照组无菌落产生，而样品组有菌落产生，则利用接种环挑取边缘菌落，用划线法接入新鲜的培养基中，于 28 ℃继续培养，待长出新菌落后，根据菌种的形态与颜色的不同，再次挑取尖端菌丝进行纯化，反复纯化至单一菌种[7-8]。

1.2.4甘草内生菌形态学鉴定。参照《常见细菌系统鉴定手册》[9]、《伯杰细菌鉴定手册》[10]、《真菌鉴定手册》[11]，根据内生菌菌落的表面形态、润泽、大小、边缘形态、颜色、质地、生长速度等特征，光学显微镜观察菌丝颜色、有无产孢、孢子形态、产孢结构、有无横隔等微观特征，并进行形态学初步鉴定。

2结果与分析

2.1甘草内生菌分离纯化在接种的样品中，从野生组分离得到12株甘草内生菌，其中内生真菌8株、内生细菌4株，从人工种植组中分离得到4株，其中内生真菌2株、内生细菌2株，分离率、定殖率见表1，部分菌种见图1。从结果可以看出，野生组所获得的内生菌数量明显高于人工种植组，其中内生真菌数量高于内生细菌的数量，并且整体来看，分离获得的甘草内生菌数量并不多。

2.2甘草内生菌菌落鉴定分离出来的甘草内生菌经过纯化培养获得单一菌株，部分菌落见图2，其菌落特点见表2，参照《常见细菌系统鉴定手册》《伯杰细菌鉴定手册》《真菌鉴定手册》对分离获得的内生菌进行初步形态学鉴定，从野生甘草样本中分离出的8株甘草内生真菌分别为青霉属Penicillium 2株，占25.0%;根霉属Rhizopus 2 株，占25.0%;木霉属Trichoderma 1 株，占12.5%;镰孢属Fusarium 3 株，占 37.5%，镰孢属是优势种属;4株甘草内生细菌均属于芽孢杆菌属Bacillus，但分别属于萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。从种植甘草样本中分离出的2株甘草内生真菌分别为根霉属Rhizopus 1株，占50.0%;镰孢属Fusarium 1株，占50.0%，分离获得内生真菌太少，无法分析其优势种属;2株甘草内生细菌均属于芽孢杆菌属Bacillus。

3讨论与结论

此次试验中分离纯化出的甘草内生菌数量较少，不够理想，分析推测其原因首先是甘草样本表面消毒条件较高（紫外照射杀菌30 min，之后用 75% 乙醇浸泡1 min，无菌水冲洗5次;3%次氯酸钠浸泡 2 min，无菌水冲洗5次;75% 乙醇浸泡1 min，无菌水冲洗5次），无论是乙醇还是次氯酸钠溶液对于甘草样本的渗透作用都较强，因此会将甘草样本浅表部分的内生菌杀死，导致样本中的内生菌数量减少，影响最终分离的结果;其次在试验初期的2次分离培养过程中都出现了空白对照阳性的情况，导致需反复对甘草表面的消毒条件进行摸索改良，错过分离甘草内生菌的最佳时期，样本中部分内生菌出现死亡，移植的样本中内生菌数较少;最后此次试验所采甘草样本中野生甘草约3年生，种植甘草约2.5年生，因此推测由于样本生长年限较短，本身也未曾共生太多内生菌，基于以上原因，最终培养获得的甘草内生菌数量较少。