硒化氨基多糖对黑鲷脾脏代谢物的影响

摘要 通过研究饲喂硒化氨基多糖后黑鲷脾脏代谢物的变化，探讨其免疫调节机制。对照组未添加硒化氨基多糖，试验组饲喂添加硒化氨基多糖的饲料，采用超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术（UPLC-QTOF-MS），结合XCMSplus软件、高分辨二级数据库对副溶血弧菌攻毒48和96 h时黑鲷脾脏内源性代谢物进行了非靶向代谢组学分析，筛选出潜在的脾脏内源性生物标志物。通过MetaboAnalyst 4.0网站进行相关代谢通路分析，揭示硒化氨基多糖调节脾脏免疫的潜在机制。结果表明，黑鲷脾脏在副溶血弧菌攻毒48和96 h时，分别有存在显著差异的31和36种潜在生物标志物，指向了8和10条代谢通路（ P <0.05）。硒化氨基多糖通过多条代谢通路增强了黑鲷脾脏的自身免疫机能。该研究结果为阐明硒化氨基多糖的免疫增强机制和合理开发免疫增强剂提供了科学依据。

关键词 超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术;非靶向代谢组学;黑鲷;硒化氨基多糖;免疫调节

中图分类号 O 657.63文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2022）14-0081-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.14.020

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Effects of Selenized Glycosaminoglycan on the Spleen Metabolites of  Acathopagrus schlegelii

ZHOU Xiu-jin1，JIANG Xiao-qiong2，SHAO Hong-hong1 et al

（1.Integrated Technical Service Center in Zhoushan Customs，Zhoushan，Zhejiang 316021;2.Zhoushan Bureau of Science and Technology，Zhoushan，Zhejiang 316021）

Abstract The changes of spleen metabolites in  Acathopagrus schlegelii  after feeding selenized glycosaminoglycan were studied，and the immunomodulatory mechanism was discussed.The selenized glycosaminoglycan was not added in control group，the feed with adding selenized glycosaminoglycan was fed in experimental group.Using UPLC-QTOF-MS，combined with XCMSplus software and high-resolution secondary database，untargeted metabolomic analysis was made on the endogenous metabolites of  A.schlegelii’s  spleen challenged by  V.parahaemolyticus  48 and 96 h，potential endogenous biomarkers of spleen were screened out.The related metabolic pathways were analyzed on MetaboAnalyst 4.0 website.The potential mechanism of selenized glycosaminoglycan in regulating the immunity of spleen was revealed.The results showed that 31 and 36 potential biomarkers were found in the spleen of  A.schlegelii  challenged by  V.parahaemolyticus  48 and 96 h respectively，which were involved in 9 and 10 metabolic pathways （ P <0.05）.The immune function of  A.schlegelii  spleen was enhanced by selenized glycosaminoglycan through multiple metabolic pathways.The study results provided the scientific basis for elucidating the immunoenhancement mechanism of selenized glycosaminoglycan and rational development of immune enhancers.

Key words UPLC-QTOF-MS;Untargeted metabolomics; Acathopagrus schlegelii; Selenized glycosaminoglycan;Immunomodulation

黑鲷 （Acathopagrus schlegelii） 因具有广温、广盐性、抗逆性强、生长迅速、肉质好等优点而成为我国东南沿海地区及太平洋西岸海水养殖的经济鱼类[1]。随着海洋经济的不断发展，黑鲷养殖集约化程度越来越高，海水中病原菌种类越来越多，黑鲷的发病率也越来越高[2]。具有噬盐性的副溶血弧菌（ Vibrio parahemolyticus ）广泛附着在海产品表面，是鱼类弧菌病中危害最大的病原菌之一[3]，是海水养殖黑鲷的主要危害因子。目前已有利用添加免疫增强剂的饲料饲喂海水鱼类来防治疾病的文献报道[4-5]。硒是海鱼机体必需的微量元素之一[6]，它参与体内一些决定性的新陈代谢。通过化学修饰方法将多糖与无机硒结合，获得硒化氨基多糖[7]。硒化氨基多糖的生物活性普遍高于硒和多糖，更易于吸收和利用[8]。目前已有关于硒化氨基多糖作为增强适应性免疫性能潜力的含硒膳食补充剂[9]的报道。目前关于外源硒可以提高黑鲷幼鱼的生长性能和血清免疫活性的相关文献[10]，但关于硒化氨基多糖对黑鲷免疫调节机制的研究报道较少。

代谢组学是以组群指标分析为基础、以高通量检测和数据处理为手段、以信息建模与系统整合为目标的系统生物学，可以直接反映机体内生物化学过程和状态的变化，在系统研究生物内源性小分子代谢物的整体和动态变化规律上具有独特优势[11-14]。目前代谢组学分析技术应用比较广泛的主要有核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技术和高分辨质谱（high-resolution mass spectrometers，HRMS）技术2种。NMR技术因具有不损失检测样品且重复性良好等特点而被广泛应用于代谢组学中[15-17]，检测灵敏度相对较低、不能完全反映代谢组学中的变化是该技术的主要缺点[18]。HRMS技术与色谱联用可获得目标化合物的相对分子量及结构信息，已成为代谢组学研究的主要技术手段[19-20]。笔者采用高通量、高灵敏度、高分辨率的UPLC-QTOF-MS技术，结合非靶向代谢组学方法，研究硒化氨基多糖调节攻毒后黑鲷免疫力的潜在机制和靶标途径，旨在为黑鲷免疫增强剂的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物试验及样本制备 低聚氨基多糖 （low molecular aminopolysaccharide，LA）分子量约50 ku;自制硒化低聚氨基多糖，其中硒有效含量为27.3 mg/g。黑鲷幼鱼由浙江省海洋水产研究所实验场提供，分组前停饲1 d，将初始体重（13.00±0.20）g的健康黑鲷幼鱼随机分成2组，每组3个重复，每个重复25尾，放入容积310 L（水体积260 L）的玻璃纤维缸内微流水式饲养。试验组饲喂添加0.6 mg Se/kg硒化氨基多糖的饲料，对照组饲喂未添加硒化氨基多糖的饲料，试验期为8 w，饲喂试验结束后停饲，黑鲷腹腔注射0.2 mL副溶血弧菌活菌液（副溶血弧菌在普通营养琼脂培养基上28 ℃下过夜培养，然后用灭菌生理盐水洗脱，稀释到试验所需菌液浓度5.5×108 CFU/mL时攻毒，观察黑鲷的健康状况并统计死亡率。对照组黑鲷脾脏分别在饥饿48和96 h时，使用MS-222（间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐60 mg/L，色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司产品）麻醉后摘取;试验组在攻毒试验48和96 h时摘取黑鲷脾脏组织，每组10个平行样，称重后液氮快速冷冻，置于-80 ℃超低温冰箱中保存，备用。

1.2 黑鲷脾脏样品前处理、超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术分析及数据处理 参考该课题组前期研究所用代谢组学分析方法[21]进行黑鲷脾脏样品前处理、液相色谱分离、黑鲷脾脏样品中的内源性代谢物检测。利用XCMSplus结合上海爱博才思分析仪器贸易有限公司（SCIEX）独有的内源性代谢物二级谱库（Metabolite HR MS2 library，该谱库包含代谢物的分子式、分子量、CAS码、结构式、一级质谱及二级质谱等信息）对质谱采集的数据进行全面的非靶向代谢组学分析[22]。采用XCMSplus软件进行内源性代谢物的主成分分析（principal component analysis，PCA），使用MetaboAnalyst 4.0 网站软件在线进行代谢通路分析。

2 结果与分析

2.1 脾脏PCA轮廓分析 黑鲷在攻毒48和96 h时均未发生死亡现象，个别鱼体在攻毒72 h时表现出摄食能力降低、游动相对缓慢，其他临床症状均不明显。在快速分析试验中，采用UPLC分析系统可以获得较高的重现性和分离效果。该试验中醋酸铵和醋酸组合的流动相为大分子代谢物和小分子代谢物提供了最佳的色谱条件。采用2种不同性质的色谱柱对脾脏样品进行分离：极性小的小分子代谢物在T3色谱柱上呈现较好的分离，极性大的小分子代谢物则在HILLIC色谱柱上分离效果最好;在正、负离子模式下对对照组、试验组攻毒48和96 h时的脾脏样本进行QTOF-MS/MS分析和数据采集。图1为各组样品典型的总离子流色谱图（total ion chromatograms，TIC）。由图1可知，对照组攻毒48和96 h时黑鲷脾脏的指纹图谱存在一定的差异，表明试验组黑鲷脾脏的内源性代谢物主要组分有明显变化。

为了考察饲喂硒化氨基多糖后副溶血弧菌活菌液攻毒后黑鲷脾脏代谢物的变化，使用XCMSplus软件分析在正、负离子模式下采集的高分辨质谱数据，采取主成分分析（PCA）方法自动进行PCA轮廓分析。黑鲷脾脏代谢PCA轮廓分析结果见图2。从图2可以看出，试验组攻毒48和96 h后，与对照组相比，在正、负离子模式下经HILLIC色谱柱和T3色谱柱分离的脾脏代谢物主成分均有明显的分离趋势，无交叉和重叠现象，表明试验组在副溶血弧菌攻毒后黑鲷脾脏代谢产物指纹图谱均发生了显著变化。

2.2 潜在生物标志物的鉴定 潜在生物标志物的鉴定方法为试样经色谱柱分离后被离子化为不同质量的离子，进入质谱质量分析器，形成赖以定性的一级和二级质谱信息，通过一级质谱信息可以确定相对分子量，利用二级质谱信息可以获得其结构碎片信息。将经T3色谱柱和HILLIC色谱柱分离，在正、负离子模式下的高分辨质谱检测结果，经检索Metabolite HR MS2 library数据库（SCIEX）发现，饲喂硒化氨基多糖的试验组攻毒48 h时共准确鉴定出31个有显著差异的潜在生物标志物，与对照组相比除甜菜碱水平升高外，30种潜在生物标志物水平呈现明显的降低趋势;攻毒96 h时共准确鉴定出36个有显著差异的潜在生物标志物，与攻毒48 h时相比，除了L-精氨酸和鸟氨酸水平升高外，其他34种潜在生物标志物水平均呈明显下降趋势;在整个试验过程中，4-胍基丁酸和α-亚麻酸呈现先上升（攻毒48 h）后下降（攻毒96 h）的趋势。这表明硒化氨基多糖对黑鲷脾脏具有显著的免疫调节作用。具体结果见表1。

2.3 代谢途径分析 根据Metabolite HR MS2 library数据库检索得出的潜在生物标志物，录入MetaboAnalyst 4.0网站，以鱼为分析模型，进行相关代谢通路分析。经分析发现，副溶血弧菌攻毒48 h时，黑鲷脾脏代谢物中有显著差异的31种潜在生物标志物主要指向8条代谢通路（ P <0.05）;攻毒96 h时，黑鲷脾脏代谢物中有显著差异的36种潜在生物标志物主要指向10条代谢通路（ P <0.05），主要涵盖缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成，氨酰转移核糖核酸合成、嘌呤代谢等，具体见表2～3。