近江牡蛎C型凝集素CRD结构域PAMPs结合谱及抑菌活性

摘要 [目的]揭示C型凝集素（CTL）在近江牡蛎固有免疫防御机制中的重要作用。[方法]采用基因克隆、蛋白表达等技术进行试验。[结果]克隆获得1种近江牡蛎CTL基因，其CDS区1 350 bp，编码449个氨基酸，含1个CRD结构域，Ca2+结合位点2关键氨基酸基序为QPS/WHD;CTL mRNA相对表达呈组织差异分布，肝胰腺、外套膜、血细胞表达量较高，其次为鳃、肌肉柱、卵巢，唇瓣表达量最少;CTL的CRD结构域体外重组蛋白具有LPS、PGN和glucan 3种PAMPs结合活性，能结合、抑制和杀死革兰氏阳性菌中的金黄色葡萄球菌、革兰氏阴性菌中的大肠杆菌和鳗弧菌，能结合、抑制但不能杀死毕赤酵母和耶罗维亚酵母。[结论]近江牡蛎CTL的CRD结构域具有较广泛的PAMPs结合谱和抑菌活性，在其固有免疫防御机制中可发挥识别、结合、抑制和杀死多种有害菌的重要作用。

关键词 近江牡蛎;C型凝集素;CRD结构域;PAMPs结合谱;抑菌活性

中图分类号 S 917.4  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2022）16-0068-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.16.019

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

PAMPs Binding Spectrum and Antibacterial Activity of C-type Lectin CRD Domain from Crassostrea rivularis

WANG Cui-li1，2

（1. Institute of Geography and Oceanography，Nanning Normal University， Nanning， Guangxi 530000;2. Key Laboratory of Environment Change and Resources Use in Beibu Gulf， Nanning， Guangxi 530000）

Abstract [Objective] In order to reveal the important role of CTL in the innate immune defense mechanism of Crassostrea rivularis. [Method]Gene cloning and protein expression else techniques were used in the experiment. [Result]The results showed that CTL was cloned by gene cloning.Its CDS region was 1 350 bp， encodes 449 amino acids. CRD domain was found in CTL gene， with QPS/WHD key motif in Ca2+ binding site 2. Quantitative real-time PCR was employed to analyze CTL mRNA level. Relative mRNA levels of CTL were the highest expression in hepatopancreas， mantle， haemocytes， followed by gill， muscle column， ovary. Relative mRNA levels of CTL was the lowest expression in lip flap. The CRD domain recombinant protein of CTL had the binding activity of LPS， PGN and glucan. The CRD domain recombinant protein of CTL could inhibit and kill Staphylococcus aureus which belong to gram positive bacteria， could inhibit Bacillus coli and Vibrio anguillarum which belong to gram negative bacteria， but could not inhibit and kill Pichia pastoris and Yarrowia lipolytica. [Conclusion]The CRD domain of CTL in Crassostrea rivularis has a wide range of PAMPs binding spectrum and antibacterial activity. It can play an important role in identifying， binding， inhibiting and killing a variety of harmful bacteria in its inherent immune defense mechanism.

Key words Crassostrea rivularis;C-type lectin;CRD domain;PAMPs binding spectrum;Bacteriostatic activity

近江牡蛎（Crassostrea rivularis）属无脊椎（Invertebrate）双壳纲（Bivalvia）贝类，自身缺乏获得性免疫，单纯依靠固有免疫系统防御疫害。C型凝集素（C-type lectin，CTL）是固有的免疫重要因子[1]，可通过糖识别域（carbohydrate recognition domain，CRD）中Ca2+结合位点2氨基酸残基的侧链羰基与微生物表面N-氨基半乳糖或甘露糖等结合形成复合体，激活下游信号传递，促进机体对外来入侵病原微生物清除，因此Ca2+结合位点2氨基酸基序可决定CTL的糖结合活性和特异性[2-5]。

已有研究显示，脊椎动物CTL中Ca2+结合位点2第1位氨基酸基序为EPN（谷氨酸-脯氨酸-天冬酰胺）或QPD（谷氨酰胺-脯氨酸-天冬氨酸），而无脊椎动物除了以上2种，还可以是EPD（谷氨酸-脯氨酸-天冬氨酸）[6]、QPG（谷氨酰胺-脯氨酸-甘氨酸）[7]、QPS（谷氨酰胺-脯氨酸-丝氨酸）[8]和YPD（酪氨酸-脯氨酸-天冬氨酸）[9]等;其第2位关键氨基酸基序也不局限于脊椎动物的WND（色氨酸-天冬酰胺-天冬氨酸），而可以是WHD（色氨酸-组氨酸-天冬氨酸）、WSD（色氨酸-丝氨酸-天冬氨酸）、WID（色氨酸-异亮氨-天冬氨酸）和WRD（色氨酸-精氨酸-天冬氨酸）[10]等。推测无脊椎动物Ca2+结合位点 2 氨基酸基序的多样性将赋予其更广泛和更多样化的糖结合活性。因此，笔者以近江牡蛎为研究对象，开展了CTL的CRD病原相关分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs）结合谱及抑菌活性研究，试验首先克隆其CTL基因，明确CRD结构域及Ca2+结合位点2氨基酸基序;其次通过体外重组CTL的CRD结构域蛋白，揭示其PAMPs结合谱及抑菌活性;研究结果将为深入了解CTL在无脊椎动物近江牡蛎固有免疫防御机制中的重要作用提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物。

近江牡蛎成贝（约2年龄）采自广西钦州湾茅尾海的2个养殖区（108°35′08″E，21°43′00″N和108°51′ 58″E，21°39′ 21″N），养殖海水条件：温度分别为31.5 ℃和31.7 ℃，盐度分别为17.7‰和17.9‰，pH分别为7.72和7.81，电导率分别为28.86和29.17 μs/cm。样品采集完毕立即送回实验室处理。

1.1.2 主要试剂。

Trizol试剂，购自MRC公司;氯仿、异丙醇、乙醇，购自中国医药集团有限公司;DEPC水，购自北京索莱宝科技有限公司;QIA quick Gel Extraction 试剂盒，购自QIAGEN公司;rTaq E、10×PCR Buffer、2.5 mmol/L dNTP、DNA Marker 2000、PMD19-T Vectors，购自TaKaRa公司;DH5α感受态细胞、X-gal、IPTG、氨苄青霉素，购自北京全式金公司;TIAN Script RT cDNA第一链合成试剂盒，购自康为试剂公司;SYBRSelect Master Mix试剂盒，购自ABI公司;Anti-6x His tag antibody一抗、Goat Anti-Rabbit lgG（HRP）二抗，购自Abcam公司;毕赤酵母、耶罗维亚酵母、金黄色葡萄球菌、鳗弧菌、大肠杆菌及所用扩增引物，购自Invitrogen公司。

1.1.3 主要仪器。

涡旋振荡仪（型号为QL-902），购自海门市其林贝尔仪器制造有限公司;酶标仪（型号为Bio-Rad iMark）、电泳仪（型号为Powerpac HV 164-5056）、梯度热循环仪（型号为T100TM），购自Bio-Rad公司;高速离心机（型号为5415D）、离心机（型号为mini spin plus）、紫外分光光度计（型号为Bio Photometer），购自Eppendorf公司;超微量紫外分光光度计（型号为NanoDrop-1 000），购自NanoDrop公司;全自动凝胶成像系统（型号为Syngene Genius），购自Syngene公司;低温恒温槽（型号为DC-1006），购自无锡沃信仪器有限公司;荧光定量PCR仪（型号为7500 FAST），购自IBM公司;生物安全柜（型号为HF Safe 760S），购自Heal Force公司;电热恒温鼓风干燥箱（型号为DHG-9070A），购自上海精宏设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因克隆。

依据GenBank数据库中已登录的长牡蛎基因组（登录号：CGI_10009560）中查询获得其CTL基因序列，利用在线生物信息学软件设计近江牡蛎CTL基因RT-PCR引物（表1）。

Trizol提取近江牡蛎组织样本中总RNA，超微量紫外分光光度计测定总RNA质量和浓度，琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性;TIAN Script RT cDNA第一链合成试剂盒进行反转录，操作按产品说明书进行;PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

1.2.2 表达谱分析。

运用Trizol法分别提取近江牡蛎成贝肝胰腺、外套膜、血细胞、鳃、肌肉柱、卵巢和唇瓣组织样品总RNA，分别取1.0 μg总RNA分别进行反转录制备cDNA模板，各组织样品设置6个平行样品。根据笔者克隆所得近江牡蛎CTL的CDS区序列（登录号：MZ411536）和GenBank数据库已登录β-actin（登录号：AF026063）序列，设计Q-PCR引物（表1），采用7500 FAST荧光定量PCR检测系统（Applied Bio systems）进行分析，2-ΔΔCT法计算近江牡蛎CTL mRNA相对表达结果。

1.2.3 体外重组CTL的CRD结构域蛋白。

将CTL/pMD19-T和pET30a载体用NdeⅠ和HindⅢ双酶切，将近江牡蛎CTL的CRD结构域目的片段与pET30a载体连接并转化至感受态细胞BL21中，重组质粒鉴定阳性表达克隆子（CTL/pET30a）;鉴定完毕将质粒二次转化至感受态细胞BL21中，分时间段IPTG诱导表达，收集菌体，诱导表达产物SDS-PAGE检测，考马斯亮蓝染色确定最佳诱导时间;在最佳诱导时间大量诱导表达，分离包涵体，过镍柱，尿素透析蛋白复性;BSA标准品加入考马斯亮蓝染色液，测定不同浓度BSA标准品的595 nm的光吸收值，绘制标准曲线;测定CTL的CRD结构域重组蛋白在595 nm的光吸收值，依据所建标准曲线计算蛋白浓度。