减肥类保健食品中非法添加西布曲明的快速检测

摘要 [目的]建立一种快速检测减肥类保健食品中非法添加西布曲明的方法。[方法]基于经典的胶体金（gold nanoparticles，GNPs）标记的免疫侧向层析试纸（lateral flow strips，LFS）技术，建立一种快速、简单、方便的传统型胶体金免疫侧向层析试纸的检测方法。[结果]制备的试纸条检测过程能够在10 min内完成，且无需复杂的前处理过程，特异性好，灵敏度高，可视化检测限可低至50 ng/mL。[结论]该方法操作简单、安全便捷，可以有效地实现减肥类保健食品中非法添加西布曲明的现场快速检测。

关键词 减肥类保健食品;西布曲明;免疫层析;快速检测

中图分类号 TS 207  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2022）18-0151-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.18.038

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Rapid Detection of Sibutramine Illegally Added to Health Food for Reducing Weight

LI Jian-hua1，YANG Wen2，QU Wei2 et al （1.Anhui Tuowei Testing Service Co.，Ltd.，Xuancheng，Anhui 242000;2.School of Food and Biological Engineering，Hefei University of Technology，Hefei，Anhui 230601）

Abstract [Objective]To establish a rapid detection method for illegally adding sibutramine in weight-loss health food.[Method]Based on the classic gold nanoparticles （GNPs） labeled immunolateral lateral flow strips （LFS） technology，a fast，simple and convenient traditional colloidal gold immunological lateral flow strips detection method was established.[Result]The detection process of the prepared strip could be completed within 10 min without complicated pretreatment，with good specificity and high sensitivity，and the visual detection limit was as low as 50 ng/mL.[Conclusion]The method is simple，safe and convenient，and can effectively detect the illegal addition of sibutramine in weight-loss health food.

Key words Weight-loss health food;Sibutramine;Immunochromatography;Rapid detection

肥胖问题逐渐年轻化，小到几岁的儿童，太过肥胖会影响身体健康，导致三高等并发症。越来越多的人开始减肥，但考虑到药物长期累积的不安全性，由纯植物或中药制成的保健品成为越来越多人的选择，因为它们的功效温和、 无副作用产生或副作用小。由于其市场占有率的不断扩大，部分不法商家利用化学药剂成分作用效果显著、快速见效的特点和人们对纯植物、纯中药等健康产品的高度信赖，在这些健康商品中擅自加入说明书中没有标明的化学成分，使通常作用缓慢的现代中成药似乎获得了速效、快捷的好处，夸大产品作用来增加商品销量，谋取不正当利益。西布曲明是一种合成类减肥药物，化学分子式为 C17H26ClN，其减肥的作用机制一直被认为是作用于中枢神经系统，通过抑制再摄取去甲肾上腺素、5-羟色胺和多巴胺，提高去甲肾上腺素、5-羟色胺和多巴胺在突触间隙的浓度，下丘脑饱食中枢保持兴奋，食欲被抑制，碳水化合物的吸收降低，达到减肥的效果[1]。西布曲明虽有一定减肥功效，但它可能会带来心脑血管还有中枢神经系统不可逆的损伤，严重的心血管风险，心率加快，血压增高，恶心、食欲不振、头晕，还可能导致中风甚至死亡[2-3]。在我国早已颁布并实施的《食品安全法》第38条明确指出“不得非法向食品中添加任何化学物质”[4-5]。西布曲明是国家明令禁止添加在保健食品中的一类化学药物，随着人们对食品安全问题的广泛重视，发展快速、经济、灵敏和高选择性的西布曲明检测方法，对于检测保健食品中是否非法添加西布曲明、保障人们食用安全具有重要意义。

对于西布曲明的传统检测方法主要有超高效液相色谱-串联质谱法[6-9]、表面增强拉曼光谱法[10-11]、高效液相色谱法[12]、气相色谱-同位素稀释串联质谱法[13]，这些方法虽然灵敏度高、准确性好，但是需要漫长的前处理过程，设备操作烦琐，对操作人员要求高，费时费力，难以满足市场监管时对大规模样品现场筛查的需求。该试验主要利用抗原抗体免疫竞争反应，制备基于胶体金（gold nanoparticles，GNPs）标记的侧向层析试纸（lateral flow strips，LFS），应用于检测非法添加在保健食品中的西布曲明，以期为现场对保健食品中西布曲明的快速筛查提供参考方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 主要试剂。氯金酸、柠檬酸三钠购于百灵威科技有限公司;蔗糖、碳酸钾、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）、酪蛋白（casein）、酪蛋白钠（Na-Casein）购于国药集团化学试剂有限公司;西布曲明标准品购于上海安谱实验科技股份有限公司;西布曲明抗体和包被原购于北京勤邦生物技术有限公司;聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）底板、玻璃纤维素膜、吸水垫、硝酸纤维素膜（nitrocellulose filter，NC膜）和羊抗鼠二抗购于上海捷一生物有限公司。

1.1.2 主要仪器。 高速冷冻离心机，Heraeus Fresco 17，美国赛默飞世尔公司;电子天平，JA2003，上海力辰科技有限公司;单反相机，A6100L，索尼有限公司;磁力加热搅拌器，JB-3A，上海雷磁有限公司;各量程移液器，芬兰雷勃公司;恒温鼓风干燥箱， 101-1B，鑫熊发仪器有限公司;微型旋涡混合仪，SI-0246，美国SI科技有限公司;试纸条喷膜仪，XYZ-3，美国BioDot;试纸条切条机，CM-4000，美国BioDot。

1.2 试验方法

1.2.1 胶体金的制备。该研究采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金。将250 mL锥形瓶放在磁力加热搅拌器上煮沸清洗4次，然后向瓶中倒入55 mL双蒸水，在搅拌状态下加入850 μL 5 g/L的氯金酸溶液，加热至微沸后，保持1 500 r/min的搅拌转速不变，迅速向锥形瓶中加入一定体积5 g/L的柠檬酸三钠溶液。观察到瓶中溶液的颜色迅速改变，透明—黑—酒红色，当锥形瓶中液体的颜色不再改变，关闭加热开关，继续搅拌5 min，冷却至室温，4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 胶体金-单克隆抗体耦联复合物的制备。

取500 μL胶体金溶液于1.5 mL离心管中，用0.1 mol/L的碳酸钾溶液调节溶液pH为弱碱性，再加入一定体积1 mg/mL的西布曲明单克隆抗体振荡反应1 h后，加入50 μL封闭剂封闭多余的位点，继续振荡反应1 h，8 000 r/min离心10 min，产生红色沉淀;去上清后用重悬液50 μL重悬即可得到西布曲明的金标抗体溶液，制备金标垫。

1.2.3 胶体金试纸条的组装。

一个完整的试纸条由支撑底板、样品垫、金标垫、NC膜和吸水垫5部分组成。首先将玻璃纤维素膜切成宽度为17 mm的条状，放置在样品垫处理液中浸泡2 h， 26 ℃烘干备用。然后将西布曲明包被原、羊抗鼠二抗用10 mmol/L磷酸缓冲液（pH=7.4）分别稀释至0.8、1.0 mg/mL，依次吸入喷膜仪后喷至NC膜上，作为检测线和质控线，26 ℃烘2 h至干燥，最后依次将吸水垫、NC膜和样品垫粘贴在底板上，用切条机切割成3 mm宽的条状。

1.2.4 试纸条的检测。

在胶体金与抗体耦联过程中，优化抗体添加量、重悬液的种类这2个关键的试验参数，确定最合适的抗体耦联量、重悬条件。

1.2.5 灵敏度检测。

将西布曲明标准品溶液用Running buffer缓冲液稀释到不同质量浓度，使西布曲明浓度分别为0、5、10、20、30、40、50、100 ng/mL，分别滴加到试纸条上进行测试，反应 10 min后观察试纸条显线结果。

1.2.6 实际样品检测。

向某市售减肥类保健食品中添加西布曲明标准品溶液，使样品中西布曲明浓度分别为0、5、10、20、30、40、50、100 ng/mL，分别滴加到试纸条上进行测试，反应10 min后观察试纸条显线结果。

2 结果与分析

2.1 西布曲明检测原理 西布曲明是小分子物质，因此基于竞争法检测原理，利用目标物质与包被原对抗体的竞争达到半定量检测的目的，其具体的检测原理如图1所示。

样本中的西布曲明标准品和T线上的西布曲明包被原均能与西布曲明抗体特异性结合并且结合的位点相同，即二者互相竞争西布曲明抗体，但西布曲明标准品比包被原的竞争能力更强。当待测样本中不存在西布曲明时，样本流动到金标垫位置时西布曲明抗体与金纳米粒子的耦联复合物未能与西布曲明结合，因此西布曲明抗体表面的识别位点没有被占据，西布曲明抗体与金纳米粒子的耦联复合物到达T线位置时，与西布曲明包被原结合，使T线显现红色，多余未结合的耦联复合物继续流动到达C线位置，羊抗鼠二抗识别西布曲明抗体，二者结合使C线显现红色，最终NC膜上C线和T线位置均显线。当待测样本中存在西布曲明时，样本流动到金标垫位置时西布曲明抗体会与待测样本中的西布曲明特异性结合，西布曲明抗体表面的识别位点被占据，因此西布曲明抗体与金纳米粒子的耦联复合物到达T线位置时，无法与西布曲明包被原结合或减少结合，从而T线颜色削弱或者消失，多余未结合的耦联复合物继续向前流动到达C线位置，羊抗鼠二抗识别西布曲明抗体，二者结合使C线显现红色，最终T线位置颜色较浅或消失，C线正常显现红色。

2.2 标记抗体量的优化

金纳米粒子与西布曲明抗体耦联复合物对试纸条的灵敏度有极显著的影响，耦联的西布曲明抗体量越大，试纸条灵敏度越低;耦联的西布曲明抗体量较小时，灵敏度提高，但也会影响试纸条C线和T线整体的显线强度。图2是与胶体金耦联的西布曲明抗体量的优化结果，该试验在500 μL体系中分别选择0.5、1.0、1.5、2.0 μL的1 mg/mL西布曲明抗体量进行标记耦联，对制备的4组试纸使用不同浓度的西布曲明进行测试，4组测试所用西布曲明浓度梯度均为0、5、50、100 ng/mL。可见，抗体体积加入的越大，T线显线越强，C线变化不明显，当加入0.5和1.0 μL抗体时，NC膜上T线几乎看不到，C线也较浅，无法很好地辨别阳性和阴性结果;当加入1.5 μL抗体时，灵敏度达到要求，但阴性T线强度仍然较浅;当加入2.0 μL抗体时，阴性T线强度适中，可以很好地区分阴性和阳性。因此最终选择与胶体金耦联的西布曲明抗体量为2.0 μL。