鱼肉中喹诺酮类兽药残留检测测量不确定度评定

摘要 [目的]找出并计算影响鱼肉中喹诺酮类兽药残留检测结果的主要因素，最后对检测结果进行更加准确、科学的表达，为以后实验室的相关检测提供减小不确定度的理论依据。[方法]依据农业部1077号公告-1—2008方法定量检测鱼肉中4种喹诺酮类兽药（环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星）残留。分析整个检测过程中对结果影响较大的主要因素，评定主要影响因素的不确定度分量，并计算扩展不确定度。[结果]该试验的不确定度主要来源有最小二乘法拟合标准曲线、回收率以及标准溶液的稀释，检测结果为环丙沙星（7.55±0.90）μg/kg、达氟沙星（7.22±1.30）μg/kg、恩诺沙星（8.48±1.90）μg/kg、沙拉沙星（8.55±1.40）μg/kg。[结论]要做到强化人员技能、提高标准溶液质量、合理设计曲线等，才能有效地控制不确定度的影响。

关键词 不确定度;扩展不确定度;喹诺酮类兽药;鱼肉;液相色谱-串联质谱

中图分类号 S 851.34+7  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2022）18-0155-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.18.039

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Evaluation of Measurement Uncertainty for the Detection of Quinolones Veterinary Drug Residues in Fish

DUAN Hong-feng

（Huainan Agricultural Product Quality and Safety Inspection Center，Huainan，Anhui 232000）

Abstract [Objective]The main factors affecting the detection results of quinolone veterinary drug residues in fish were found out and calculated，and finally the detection results were expressed more accurately and scientifically，so as to provide a theoretical basis for reducing the uncertainty of related laboratory tests in the future.[Method]According to the Ministry of Agriculture Announcement No.1077-1-2008，the residues of four quinolone veterinary drugs （ciprofloxacin，danofloxacin，enrofloxacin，and sarafloxacin） in fish were quantitatively detected.The main factors that have a great influence on the results in the whole detection process were analyzed，the uncertainty components of the main influencing factors were evaluated，and the expanded uncertainty was calculated.[Result]The main sources of uncertainty in this test were the least squares fitting of the standard curve，the recovery rate and the dilution of the standard solution，the test results were ciprofloxacin （7.55±0.90） μg/kg，danofloxacin （7.22±1.30） μg/kg，enrofloxacin （8.48±1.90） μg/kg，sarafloxacin （8.55±1.40） μg/kg.[Conclusion]To strengthen people's skills，improve standard solution quality，reasonable curve design，etc.，can effectively control the impact of uncertainty.

Key words Uncertainty;Expanded uncertainty;Quinolone veterinary drugs;Fish;Liquid chromatography-tandem mass spectrometry

喹诺酮类药物（quinolones），又称吡酮酸类或吡啶酮酸类，是人工合成的含4-喹诺酮基本结构的抗菌药，其发展迅速，目前已有四代产品。因其具有抗菌谱广、抗菌活性强、与其他抗菌药物无交叉耐药性、毒副作用小、组织穿透力强、结构简单、给药方便等特点，被广泛应用于水产养殖中，主要作用是促进畜禽和鱼类生长以及预防治疗疾病，在水产养殖业中用于疾病防治，由于缺乏相应的科学理论指导，长期不合理使用这类抗菌药，导致细菌产生耐药性，在动物体内积累产生一定的残留，对人体健康构成威胁，若长期食用被此类药物残留物染的食品，可能诱导人类病原微生物产生耐药性和抗药性，严重时，会对食用者产生直接毒性及潜在“三致”（致癌、致畸、致突变），从而影响该类药物的临床疗效，控制喹诺酮类药物在水产品中的残留至关重要[1-5]。因此，检测水产品中喹诺酮类兽药残留并保证结果的可靠性十分重要，那么评定其不确定度就具有重要意义。目前常用的检测方法有高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法、酶联免疫吸附法、胶体金免疫层析法，采用液相色谱-串联质谱法测定鱼肉中环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星能更加准确的定量[6]。

测量不确定度作为测量结果的一部分，合理表征了被测量值的分散性，对测量结果的可信性、可比性和可接受性都有重要影响，是评价测量活动质量的重要指标[7]。该试验采用农业部1077号公告-1—2008方法[8]对鱼肉样品中4种喹诺酮类兽药残留进行检测，待测草鱼样品来源于淮南市2021年风险监测抽样。

1 材料与方法

1.1 主要仪器设备 PL602E、XA205DU电子天平（梅特勒-托利多）;I-Class XEVOTQ-Micro超高效液相色谱质谱联用仪（美国Waters公司）;环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星液标混标，氘代环液沙星、氘代恩诺沙星内标混标（天津阿尔塔）。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液稀释。

准确吸取环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星100 μg/mL的液标混标储备液1 mL，置于100 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度线配制成1 μg/mL的标准工作液A，再吸取A液1 mL置于10 mL容量瓶中配制成0.1 μg/mL的混合标准工作液B;用同样的方法将内标混标储备液稀释成1 μg/mL的混合内标标准工作液;吸取一定量的混合内标标准工作液分别加入空白样品中，经过前处理上机得到浓度为5、10、20、50、100、200 ng/mL的工作曲线。

1.2.2 样品前处理。

称取（5.00±0.02）g鱼肉样品于50 mL离心管中，准确加入50 μL混合内标标准工作液，涡旋混合30 s，避光放置10 min，加入5 g无水硫酸镁，涡旋混匀，再加入20 mL酸化乙腈，涡旋混合1 min，超声提取10 min;7 000 r/min 离心5 min，取上清液于125 mL梨形瓶中。残渣再重复提取一次，合并2次提取液，于40 ℃旋蒸至干。加1.0 mL甲醇溶液溶解残留物并过0.2 μm滤膜，最后用液相色谱-串联质谱仪测定。

1.3 建立结果计算的数学模型 测定结果由仪器工作站按内标法自动计算，样品中喹诺酮类兽药残留量按公式（1）计算。所有的数据均按照《数值修约规则与极限数值的表示和判定》[9]方法进行修约。

X=C×V×1 000m×1 000（1）

式中，X为样品中待测组分的含量（μg/kg）;C为测定液中待测组分的浓度（ng/mL）;V为样品定容体积（mL）;m为样品称样量（g）。

2 结果与分析

依据JJF 1059.1—2012[10]，评估不确定度时，应该是集中精力分析贡献最大的不确定度分量[11]，然后合成标准不确定度，给出扩展不确定度，最后准确表述检测结果。对检测和校准结果测量不确定度来源的识别应从分析测量过程入手，即对测量方法、测量系统和测量程序进行详细研究[12]。该试验不确定度来源主要有样品称量、标准溶液、方法回收率、样品定容、结果重复性以及最小二乘法拟合曲线引入的不确定度，将所有不确定度来源进行整理，然后再逐个进行分析。鱼肉中喹诺酮类兽药残留检测的不确定度来源如图1所示。

2.1 样品称量引入的不确定度

样品称量过程中不确定度来源主要有天平的校准和重复性。①天平校准引入的不确定度。仪器检定证书给定的允差（α）为±0.05 g，按矩形分布，包含因子k=3，则校准引入的标准确定度为u1（m）=k=0.029 g。

②天平重复性引入的不确定度。重复性的不确定度计算为0.5×最后一位有效数字[13]，百分之一天平最后一位有效数字为0.01 g，则重复性引入的不确定度为u2（m）=0.005 g，样品称量引入的标准不确定度为uc（m）=0.029 g，相对标准不确定度为urel（m）=0.005 8。

2.2 标准溶液引入的不确定度 标准溶液不确定度来源主要有标准溶液浓度、标准溶液稀释和标准溶液添加。

2.2.1 标准溶液浓度引入的不确定度。由标准物质证书得到环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星的浓度分别为100.2、100.3、99.6、100.5 μg/mL，扩展不确定度（U）均为±5%，包含因子k为 则相对标准不确定度均为urel（P）=Uk=0.025 0。

2.2.2 标准溶液稀释引入的不确定度。

标准溶液进行两级稀释，用到100、10 mL容量瓶以及1 000 μL移液枪，不确定度来源主要有容量瓶和移液枪的校准、温度、重复性，不确定度分量如下。

2.2.2.1 100 mL容量瓶引入的不确定度。

（1）校准引入的不确定度。依据《常用玻璃量器检定规程》给出的容量允差为±0.10 mL，按三角分布[14-15]，k=6，则校准引入的标准不确定度为u1（V100）=0.041 mL。

（2）温度变化引入的不确定度。容量瓶检定温度为22 ℃，实验室温度变化为±4 ℃，甲醇的膨胀系数为0.001 24，甲醇的体积变化△V=±0.496 mL，按矩形分布[16]，则温度变化引入的标准不确定度为u2（V100）=0.290 mL。

（3）重复性引入的不确定度。10次重复称量得到标准偏差为0.023 mL，则重复性引入的标准不确定度为u3（V100）=0.023  mL。

100 mL容量瓶引入的标准不确定度为uc（V100）=0.290 mL，相对标准不确定度为urel （V100）=0.002 9。

2.2.2.2 10 mL容量瓶引入的不确定度。计算过程同“2.2.2.1”，容量允差为±0.020 mL，校准引入的标准不确定度为u1（V10）=0.008 mL，温度变化引入的标准不确定度为u2（V10）=0.029 mL，10次重复称量得到标准偏差0.003 mL，重复性引入的标准不确定度为u3（V10）=0.003 mL，则10 mL容量瓶引入的标准不确定度为uc（V10）=0.030 mL，