通过式固相萃取-超高效液相色谱串联质谱法同时测定猪肝中19种磺胺类兽药残留

摘要 [目的]建立一种通过式固相萃取柱净化-超高效液相色谱串联质谱法测定猪肝中19种磺胺类药物残留的分析方法。[方法]样品均质后，使用80%的乙腈水溶液超声提取10 min，使用ProElut PLS-A固相萃取柱进行净化，使用BEH C18色谱柱进行分离，以0.1%的甲酸水和0.1%甲酸乙腈甲醇混合液（1+1）为流动相按比例进行梯度洗脱，使用正离子模式。采用质谱多重反应监测模式（MRM），采用空白基质绘制标准曲线定量。[结果]19种磺胺类药物在2～80 μg/L呈现良好的线性关系（R2>0.99），方法检出限为0.1～1.4 μg/kg，定量限为0.3～4.7 μg/kg，方法的回收率为74.8%～123.2%，精密度相对标准偏差（RSD）<5%。[结论]该方法操作流程简便、结果准确可靠，可应用于猪肝中磺胺类药物残留的检验检测方法。

关键词 固相萃取;超高效液相色谱串联质谱法;磺胺类药物;兽药残留;猪肝

中图分类号 S 859.84  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2022）18-0159-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.18.040

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Simultaneous Determination of 19 Sulfonamides Drugs Residues in Pig Liver by Pass-Though Solid Phase Extraction Coupled with Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

WANG Zhan-hua， WANG Yi-han， SHI Bei et al

（Key Laboratory of Functional Food Nutrition and Quality Safety for State Market Regulation， Key Laboratory of Health Food Quality Safety of Provincial Market Regulation， Zhejiang Institute of Food and Drug Control， Hangzhou，Zhejiang 310052）

Abstract [Objective] To establish an analytical method for the determination of 19 kinds of sulfonamides residues in pig liver by solid-phase extraction column clean up-ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry.[Method]After the sample was homogenized，it was ultrasonically extracted with 80% acetonitrile aqueous solution for 10 min， purified with ProElut PLS-A solid phase extraction column， and separated with BEH C18 chromatographic column.0.1% formic acid water and 0.1% formic acid acetonitrile methanol mixture （1+1） were used as mobile phases for gradient elution. Positive ion mode and mass spectrometry multiple response monitoring mode （MRM） was used for determination. External standard method was used for quantification.[Result] The 19 sulfonamides showed a good linear relationship at 2-80 μg/L （R2>0.99）， the detection limit of the method was 0.1-1.4 μg/kg，and the quantification limit was 0.3-4.7 μg/kg. The recovery rate of the method was 74.8%-123.2%， precision relative standard deviation （RSD） <5%.[Conclusion]The method is simple， accurate and reliable， and can be used for the detection of sulfonamides drug residues in pig liver.

Key words Solid phase extraction;Ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry;Sulfonamides drugs;Veterinary drug residues;Pig liver

磺胺类药物（sulfonamides，SAs）是一种以对位氨基苯磺酰胺（简称磺胺）为基本结构的药物。磺胺类药物具有抗菌谱广、抗菌能力强、毒性小、易吸收、价格便宜等优点[1-2]。由于磺胺药的抗菌机理为抑制微生物生长，高投药量能够明显增加抑菌效果，为了达到抑菌效果，养殖户在实际使用中存在滥用磺胺类药物的现象。磺胺类药物通过食品链进行富集，会导致消费者产生过敏反应、肾脏损害、中枢神经系统和胃肠道反应[3-4]。为了保障我国人民的食品安全，目前我国国家标准GB 31650—2019《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》中规定了动物源性食品中磺胺总量的最高残留不得高于100 μg/kg。

目前用于动物性食品中磺胺类药物残留检测的方法主要有液相色谱法（HPLC）[5-8]、酶联免疫法（ELISA）[9]、液相质谱联用法（HPLC-MS）。近年来，液相质谱联用法因其检出限度低、定量定性准确，成为动物源性食品中兽药残留检测应用最为广泛的技术[10-15]。用于液相质谱联用法检测的样品前处理技术主要有液液萃取[16]、固相萃取。其中固相萃取又分为基质分散固相萃取[17-20]、吸附-洗脱式固相萃取、通过式固相萃取。基质分散固相萃取主要用于简单基质的净化，用于动物源性样品净化需要使用专用增强型脂质型净化材料，检测成本较高，而且按样品性质按比例配制净化材料用量，对于不同基质的样品通用性不强。吸附-洗脱式固相萃取是目前应用最广泛的固相萃取净化技术，在动物源性药物残留的检测中，通常使用水相提取溶液，净化需经过固相萃取柱活化、上样、淋洗、洗脱等步骤，由于动物源样品的水相提取液中会含有游离脂肪和蛋白质等大分子物质，在上样、淋洗、洗脱步骤中极易堵塞固相萃取柱，导致试验时间延长和样品回收率不稳定[21]。通过式固相萃取[22-24]是一种新型的固相萃取技术，在直接上样、接收的同时又能够有效保证去除基质干扰，有效地解决了常规吸附-洗脱式固相萃取、步骤烦琐、耗时长的缺点。

笔者选取日常监督抽检中需要检测的19种磺胺类药物，以基质较为复杂的猪肝为研究基质，建立通过式固相萃取-超高效液相色谱串联质谱法同时测定猪肝中19种磺胺类兽药残留的方法，并完成方法的稳定性和适应性的研究，以期满足日常监督抽检中动物源性食品中磺胺类药物快速检测的需要，同时对动物源性磺胺类药物残留检测标准制定和更新具有重要的借鉴意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试剂。

标准品：乙酰磺胺（纯度99.0%）、磺胺吡啶（纯度99.0%）、磺胺嘧啶（纯度99.0%）、磺胺甲噁唑（纯度99.6%）、磺胺噻唑（纯度99.5%）、磺胺甲嘧啶（纯度99.5%）、磺胺二甲异噁唑（纯度99.8%）、磺胺甲噻二唑（纯度99.4%）、苯甲酰磺胺（纯度99.3%）、磺胺二甲异嘧啶（纯度99.0%）、磺胺甲氧哒嗪（纯度99.2%）、磺胺氯哒嗪（纯度99.1%）、磺胺邻二甲氧嘧啶（纯度98.0%）、磺胺间二甲氧嘧啶（纯度99.5%）、磺胺苯吡唑（纯度99.8%），德国Dr.Ehrenstorfer公司;磺胺对甲氧嘧啶（纯度99.5%）、磺胺间甲氧嘧啶（纯度97.5%），中国食品药品检定研究院;磺胺二甲嘧啶（纯度100.0%），中国药品生物制品检定所;酞磺胺噻唑（纯度99.7%），北京安谱公司。磺胺类药物混合标准储备液（浓度100 mg/L），北京曼哈格公司。

甲醇、乙腈（质谱纯，德国Merck公司）;甲酸（色谱纯，美国sigma 公司）;ProElut PLS-A（200 mg，6 mL）固相萃取柱（北京迪马公司）;Waters Acquity BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美国Waters公司）;ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm，美国Waters公司）;0.22 μm PTFE过滤头（美国Agilent公司）。

1.1.2 试材。

猪肝样品购于浙江省内不同农贸市场。

1.1.3 仪器与设备。

Shimadzu LC-30A高效液相色谱仪（日本岛津公司）;SCIEX Triple Quad 5500-QTRAP Activated质谱仪（美国ABSciex公司）;Milli-Q超纯水仪（德国默克密理博公司）;LYNX 6000 超速离心机（美国热电公司）;XPE205分析天平（瑞士梅特勒公司）;MultiReax多通道旋涡混合器（德国Heidolph公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液的配制。

1.2.1.1

磺胺类药物单标标准储备液的配制。准确称取乙酰磺胺、磺胺吡啶等19种标准品分别置于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解后定容，配成1 mg/mL的磺胺类药物储备液，在-18 ℃冷冻保存。

1.2.1.2

磺胺类药物单标标准工作液的配制。分别精密移取25 μL标准储备液，用初始流动相稀释至50 mL，配成500 μg/L的磺胺类药物中间液，使用时，分别精密移取各单标中间液用初始流动相稀释至所需浓度。

1.2.1.3

磺胺类药物标准混合工作液的配制。精密量取100 μL 磺胺类药物混合标准储备液，用初始流动相稀释至10 mL，配成1 mg/L磺胺类药物中间液，使用时，分别精密移取适量的中间液，用空白基质稀释至所需质量浓度，配制成混合标准工作液。

1.2.2 样品前处理。

精密称取5 g均质后的试样于50 mL离心管中，加入乙腈-水（V/V=80/20）20.0 mL，超声提取10 min后，于MultiReax多通道旋涡混合器中涡旋提取30 min，6 000 r/min 高速离心20 min，取4.0 mL上清液过ProElut PLS-A固相萃取柱后，用2.0 mL乙腈-水（V/V=80/20）淋洗，收集全部流出液。将全部流出液45 ℃下氮吹近干，1.0 mL甲醇-乙腈-水混合溶液（V/V/V=1/1/18）复溶，复溶液使用0.22 PTFE过滤头过滤至进样瓶，待测。

1.2.3 色谱质谱条件。

1.2.3.1

色谱条件。岛津LC-30AD超高效液相色谱系统串联Applied Biosystems Qtrap 5500三重四级杆质谱仪，包括二元泵，在线脱气，自动进样器;色谱柱为Waters Acquity BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）;柱温35 ℃;流动相为0.1%甲酸混合水溶液（A）和0.1%甲酸甲醇-乙腈混合溶液（V/V=1/1）（B）;梯度洗脱程序：0～2 min，10%B，2～8 min，10%～80%B，8～11 min，80%～10%B;流速0.35 mL/min;进样量2 μL。