基于磁性纳米粒子的固定化胰脂肪酶制备条件的研究

摘 要：胰脂肪酶（Pancreatic Lipase，PL）作为一种高效的生物催化剂和治疗肥胖的关键靶点，已经在食品工业和医药领域广泛应用，但游离胰脂肪酶稳定性较差，活力不易保持且难以重复利用。本研究以磁性纳米粒子（Magnetic Nanoparticles，MNPs）为载体，利用MNPs与PL的亲和作用，构建了PL功能化的MNPs（PL-MNPs）筛选模型。以PL的酶固载量和相对酶活为考察指标对PL-MNPs的合成条件进行单因素和响应面优化，确定PL-MNPs的最佳合成条件为pH=6.53，酶浓度25.28 mg·mL-1，固定化温度30.69 ℃，固定化时间3.00 h。在此条件下，理论酶固载量为144.95 μg·mg-1，相对酶活为94.27%。

关键词：胰脂肪酶；磁性纳米粒子；固定化酶

Study on the Preparation Conditions of Immobilized Pancreatic Lipase Based on Magnetic Nanoparticles

LIU Cuicui1， CHEN Yushi2

（1.Food and Drug Safety Inspection Center of Maanshan， Maanshan 243000， China; 2.School of Chemistry， Fuzhou University， Fuzhou 350000， China）

Abstract： Pancreatic lipase （PL）， as an efficient biocatalyst and key target for treating obesity， has been widely used in the food industry and pharmaceutical fields. However， the stability of free pancreatic lipase is poor， and its activity is difficult to maintain and reuse. In this study， magnetic nanoparticles （MNPs） were used as carriers， and a PL-functionalized MNPs （PL-MNPs） screening model was constructed by using the affinity between MNPs and PL. The synthesis conditions of PL-MNPs were optimized by single factor and response surface methodology based on the enzyme immobilized capacity and relative enzyme activity of PL. The optimum synthesis conditions were determined as follows： pH=6.53， enzyme concentration 25.28 mg·mL-1， immobilization temperature 30.69 ℃ and immobilization time 3.00 h. Under these conditions， the theoretical enzyme immobilized capacity was 144.95 μg·mg-1 and the relative enzyme activity was 94.27%.

Keywords： pancreatic lipase; magnetic nanoparticles; immobilized enzymes

胰脂肪酶（Pancreatic Lipase，PL）是一种羧酸酯酶，由胰腺腺泡细胞分泌，能够消化水解膳食中50%～70%的三酰甘油酯[1]，是开发抗肥胖药物的重要靶点。然而游离胰脂肪酶存在分离纯化成本高，活性容易受到外界环境影响，无法回收再利用等问题，限制了其工业化应用[2]。因此，将胰脂肪酶与合适的载体结合以固定化，改善其稳定性并提高重复利用率，具有广泛的应用前景[3-4]。磁性纳米粒子（Magnetic Nanoparticles，MNPs）又称磁珠，是一种由磁性物质和非磁性聚合物复合而成的粒子尺寸在0～100 nm的新型材料[5]。由于具有高比表面积、高稳定性、低毒和高传质性，常作为固定化良好载体，实现长效释放和靶向传递，从而保护和提高活性化合物的生物利用度[6]。将酶固定在修饰的MNPs上，酶的耐酸碱性、热稳定性和储存稳定性都会有很大提升[7]。本文将MNPs与PL结合，制备固定化胰脂肪酶（PL-MNPs），并对其制备条件进行优化，为胰脂肪酶的应用和研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

M3-P100羧基磁珠购自上海奥润科技有限公司；胰脂肪酶（PL）购自美国Sigma公司；4-硝基苯基丁酸酯、2-吗啉乙磺酸（MES）、N-羟基丁二酰亚胺（NHS）、1-乙基-3[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐（EDC）均购自麦克林生物试剂有限公司；Tween-20购自中广东西陇化工有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

磁分离架BeyoMag，上海化科实验器材有限公司；磁力搅拌器Big Squid，德国IKA公司；涡旋混匀仪VORTEX-5，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；旋转混匀器Thermomixer，北京康高特仪器设备有限公司；多功能酶标仪SpectraMax·iD3，美谷分子仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 固定化PL（PL-MNPs）的合成

（1）磁珠的活化。取羧基磁珠溶液200 μL于2 mL的离心管，加入MEST溶液（含Tween-20的MES溶液）500 μL置于旋转混匀器振荡混匀，在磁分离架上磁分离去除上清液，重复洗涤3次后加入200 μL EDC和NHS溶液继续振荡混匀1 h后，进行磁分离去除上清液，最后用MEST溶液重复洗涤4次去除上清液后，于4 ℃冰箱保存备用。

（2）PL的固定化。取650 μL PL溶液于装有活化磁珠的离心管中，振荡混匀1 h后进行磁分离去除上清液，加入PBST溶液（含Tween-20的PBS溶液，含有1%甘氨酸，0.05% Tween-20）重复洗涤4次后去除上清液，加入PBST溶液1 mL于4 ℃保存备用。

1.3.2 酶固载量与酶活力的测定

（1）酶固载量的测定。测定PL固定前后于595 nm处的吸光度值，代入以牛血清白蛋白（BSA）为标准物质绘制的曲线方程中，计算获得PL固定前后上清液的蛋白浓度，并按照公式（1）[8]求得固定后PL-MNPs的酶固载量。

（1）

式中：E为PL-MNPs的固载量，μg·mg-1；C1为固定PL前溶液蛋白含量，μg·mL-1；C2为固定PL后上清液蛋白含量，μg·mL-1；C0为游离磁珠的浓度，mg·mL-1；V1为加入的PL溶液体积，mL；V0为加入的磁珠体积，mL。

（2）酶活力的测定。取Tris-HCl缓冲液800 μL，已配制好的固定化PL溶液（PL-MNPs）100 μL于2 mL的离心管中，37 ℃恒温水浴10 min后，加入4-硝基苯丁酸酯（pNPB，10 mmol·L-1）溶液100 μL，37 ℃水浴10 min后，吸取200 μL于96孔板中，依次测定不同孔溶液于405 nm处的吸光度值，空白对照组不添加PL-MNPs，并按照公式（2）[9]计算酶活。

（2）

式中：M为PL-MNPs的酶活；C2为pNPB的浓度，mmol·L-1；C0'为PL溶液中的蛋白含量，μg·mL-1；V2为反应体系总体积，mL；V0'为PL溶液体积，μL；t为反应时间，min。

相对酶活按照公式（3）[10]计算。

（3）

式中：X为PL-MNPs的相对酶活，X1为PL-MNPs的酶活力，X2为游离PL的酶活力。

1.3.3 PL-MNPs固定化条件的优化

（1）单因素试验。①缓冲液pH值。磁珠浓度（10 mg·mL-1），用不同pH值（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）的PBS缓冲液配制PL（5 mg·mL-1）溶液，于温度30 ℃，振荡速率810 r·min-1下混匀3 h。②PL浓度。磁珠浓度（10 mg·mL-1），用PBS缓冲液（pH=6.5）配制不同浓度（5 mg·mL-1、10 mg·mL-1、15 mg·mL-1、20 mg·mL-1、25 mg·mL-1、30 mg·mL-1）的PL溶液，于温度30 ℃，振荡速率810 r·min-1下混匀3 h。③固定化温度。磁珠浓度（10 mg·mL-1），用PBS缓冲液（pH=6.5）配制PL（25 mg·mL-1）溶液，分别置于不同温度（25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃），振荡速率810 r·min-1下混匀3 h。④固定化时间。磁珠浓度（10 mg·mL-1），用PBS缓冲液（pH=6.5）配制PL（25 mg·mL-1）溶液，于温度30 ℃，振荡速率810 r·min-1下混匀1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h。

（2）响应面试验优化。根据单因素试验结果，选择对PL-MNPs酶固载量和酶活影响较为显著的因素，pH（A）、PL浓度（B）与固定化温度（C）为自变量，利用Design-Expert 8.0.6软件的Box-Behnken设计模型进行3因素3水平的响应面试验（表1）。

2 结果与分析

2.1 PL-MNPs固定化条件单因素优化结果

2.1.1 缓冲液pH值对PL-MNPs制备影响

PBS缓冲液的不同pH值对PL-MNPs的酶固载量和相对酶活的影响如图1所示。随着pH值从5.5提高至6.5，PL-MNPs的酶固载量和相对酶活均逐渐增大；继续增大pH值，PL-MNPs的酶固载量和相对酶活均逐渐降低。说明PL-MNPs最适pH值为6.5。

2.1.2 PL浓度对PL-MNPs制备影响

不同PL浓度对PL-MNPs的酶固载量和相对酶活的影响如图2所示。随着PL浓度从5 mg·mL-1提高至25 mg·mL-1，PL-MNPs的酶固载量和相对酶活均呈现出逐渐升高的趋势；继续增加PL浓度，PL-MNPs的固载量趋于平缓，相对酶活下降。故选择PL最佳浓度为25 mg·mL-1。

2.1.3 温度对PL-MNPs制备影响

不同固定化温度对PL-MNPs的酶固载量和相对酶活的影响如图3所示。随着温度从25 ℃提高至35 ℃，PL-MNPs的酶固载量和相对酶活均逐渐增大；继续升高温度，PL-MNPs的固载量和相对酶活均呈现下降趋势。故选择35 ℃为最适固定化温度。

2.1.4 时间对PL-MNPs制备影响

不同固定化时间对PL-MNPs的酶固载量和相对酶活的影响如图4所示。由图4可以看到，随着固定化时间从1 h增加至3 h，PL-MNPs的酶固载量和相对酶活均逐渐增大；继续延长固定化时间，PL-MNPs的固载量和相对酶活均下降。故选择3 h为PL-MNPs的最适固定化时间。

2.2 PL-MNPs制备条件响应面优化