高效液相色谱法检测食用油中黄曲霉毒素B1的含量

摘 要：目的：建立一种利用高效液相色谱技术检测食用油内黄曲霉毒素B1含量的方法。方法：以甲醇-水体系对样品进行萃取，通过黄曲霉毒素B1特异性免疫亲和柱进行净化处理，并以甲醇作为洗脱剂进行洗脱，使用高效液相色谱仪进行检测分析。结果：黄曲霉毒素B1浓度在0.1～40.0 ng·mL-1线性关系良好，相关系数为0.999 6；方法的平均回收率在97.2%～100.3%，相对标准偏差在0.4%～0.9%；方法检出限为0.029 μg·kg-1，定量限为0.098 μg·kg-1，均满足检测要求。结论：该方法快速高效、操作简便，且试剂耗材消耗少，适用于检测食用油中黄曲霉毒素B1的含量。

关键词：高效液相色谱法；食用油；黄曲霉毒素B1；含量测定

Determination of Aflatoxin B1 in Edible Oil by High Performance Liquid Chromatography

CHEN Xuyin， LUO Lin， SHAN Hua， WANG Huadong*

（Guizhou Jintaili Grain and Oil Development Co.， Ltd.， Guiyang 550014， China）

Abstract： Objective： To establish a method for the determination of aflatoxin B1 in edible oil by high performance liquid chromatography （HPLC）. Method： The samples were extracted by methanol-water system， purified by aflatoxin B1 specific immunoaffinity column， eluted with methanol as eluent， and analyzed by HPLC. Result： Aflatoxin B1 concentration has a good linear relationship in the range of 0.1 ng·mL-1 to 40.0 ng·mL-1， the correlation coefficient was 0.999 6; the average recoveries ranged from 97.2% to 100.3%， and the relative standard deviations ranged from 0.4% to 0.9%; the limits of detection and quantitation were 0.029 μg·kg-1 and 0.098 μg·kg-1， both of which met the detection requirements. Conclusion： The method is fast， efficient， easy to operate， with less consumption of reagents and consumables. It is suitable for the determination of aflatoxin B1 in edible oil.

Keywords： high performance liquid chromatography; edible oil; aflatoxin B1; content determination

黄曲霉毒素来源于黄曲霉和寄生曲霉，是一类严重危害人体健康的霉菌毒素[1]。其中，黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）因其强致癌性和高毒性而备受关注[2]。AFB1广泛存在于土壤、动植物以及各种坚果中，主要污染粮油及其制品，如花生、花生油、玉米、大米、棉籽、啤酒和酱油等，对食品安全构成了严重威胁[3-4]。高效液相色谱法因其高压、高效、高速、高灵敏度及高选择性等特点，在食品分析领域得到广泛应用[5]。然而，现有利用高效液相色谱法检测食用油中AFB1含量的方法仍存在一些不足，如部分方法的净化步骤复杂、试剂消耗量大、操作流程复杂等。为克服这些不足，本文致力于建立一种更为优化的利用高效液相色谱法检测食用油中AFB1含量的方法，从而保障食用油的质量安全。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器及试剂

菜籽油，市售。

1260 Infinity型高效液相色谱仪配PHRED-HR-光化学衍生器，美国安捷伦公司；AP-02B型真空泵，天津奥特赛恩斯仪器有限公司；电子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；QF-3800氮吹仪，北京华盛谱信公司；SK-1旋涡混合器，金坛市中大仪器厂；免疫亲和柱（黄曲霉毒素B1专用），天津博纳艾杰尔科技有限公司。

碘，天津科密欧试剂有限公司；乙腈、甲醇、正己烷，北京迪马科技有限公司；黄曲霉毒素B1标准品（浓度为100 μg·mL-1，批号为1162-65-8），坛墨质检科技有限公司；黄曲霉毒素B1标准品（浓度为2 μg·mL-1，批号为SB05-195-2008），农业农村部环境保护科研监测所；实验用水为超纯水。

1.2 色谱条件

选用Thermo UMISil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）进行分离。流动相为甲醇与水混合溶液（50∶50，V/V）。荧光检测条件设置为激发波长360 nm，发射波长440 nm。为确保分离效果，流动相流速设定为1.0 mL·min-1，并维持柱温在35 ℃。此外，衍生化步骤采用质量分数为0.05%的碘溶液，流速设置为0.2 mL·min-1。

1.3 标准溶液的配制

准确吸取1.0 mL的黄曲霉毒素B1标准物质，将其转移至100 mL容量瓶中，使用乙腈作为稀释剂添加至刻度线，获得浓度为1 µg·mL-1的标准储备液，4 ℃保存。精准量取0.5 mL的上述储备液，转移至50 mL容量瓶中，再以流动相作为稀释液添加至刻度线，得到浓度为10 ng·mL-1的中间液。通过精确量取一定量制备的标准储备液以及中间液，配制具有不同浓度梯度的标准工作液，分别为0.1、0.5、2.0、5.0、10.0、20.0 ng·mL-1及40.0 ng·mL-1。

1.4 样品的提取及净化

称取5.0 g样品于50 mL离心管中，添加84∶16（V/V）乙腈和水混合液，通过涡旋方式使其混合均匀，然后超声提取20 min，以6 000 r·min-1的转速离心10 min，量取4 mL上清液，加入超纯水12 mL，充分混匀。在固相萃取装置上安装免疫亲和柱，并弃去其中的保护液，调压使样品液以2 mL·min-1过柱，用10 mL水淋洗两次后，抽干亲和柱。添入2 mL甲醇以2 mL·min-1洗脱，收集洗脱液，经0.22 μm滤膜过滤，得待测样液。

2 结果与分析

2.1 确定液相色谱条件

测试不同比例甲醇-水流动相（30∶70、40∶60、45∶55、50∶50，V/V）对检测效果的影响。当甲醇与水的比例为30∶70时，观察目标峰的保留时间较长，且峰形较宽，可能是流动相的极性较强，导致目标化合物在色谱柱上的保留行为发生变化，同时也使得样品中的一些杂质与目标峰的分离效果不理想，杂质干扰较为明显，从而影响了对目标化合物的准确检测。甲醇与水的比例为40∶60和45∶55时，目标峰的保留时间逐渐缩短，峰形有所改善，但仍未达到理想状态。在这两种比例下，虽然部分杂质与目标峰的分离程度有所提高，但仍存在一定程度的重叠，可能会对定量分析造成一定误差。当甲醇与水的比例调整为50∶50时，目标峰呈现对称形态，样品中的杂质干扰较小，明显提高了检测的准确性和可靠性。因此，选择流动相甲醇与水的比例为50∶50进行后续实验。

2.2 线性关系分析

根据1.2项色谱条件，分析各浓度标准溶液。以黄曲霉毒素B1的浓度为横坐标，以其对应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，结果如图1所示。线性回归方程为Y=27 217.3X，R2=0.999 6，表明具有良好的线性关系。

2.3 回收率和精密度

选取9份阴性样品各5 g，分别加入不同量黄曲霉毒素B1标准品，根据1.4项所述流程制备待测样品溶液，并在1.2项中所述的色谱条件下进行测定，加标回收实验结果如表1所示。结果表明，在高、中、低3个加标水平下，样品的平均回收率分别为100.3%、98.4%和97.2%，相对标准偏差在0.4%～0.9%，满足《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）的标准要求。

2.4 重复性验证

为验证方法的重复性，选取5 g阳性样品，在相同条件下进行6次重复测定。经计算，相对标准偏差为0.6%，符合国家标准GB/T 27404—2008所设定的30%的允许偏差。具体数据见表2。

2.5 质控样考察

称取5 g质控样品各3份，根据1.4项所述方法制备待测样品溶液，并在1.2项色谱条件下进行分析测定，最终测得结果为1.62 µg·kg-1。样品来源于大连中食国实检测技术有限公司（编号为CFAPA-QC618B-1），参考值为1.55 µg·kg-1。采用Z检验方法，经计算得，Z值为0.5，符合|Z|≤2的接受标准。

2.6 检出限与定量限

为评估检出限，取6份5 g阴性样品，各加0.15 ng黄曲霉毒素B1标准品，按1.4项制备样品并依据1.2项对其进行测定，分别以3倍信噪比和10倍信噪比对应的浓度作为方法的检出限和定量限。结果显示，样品的浓度为0.029 µg·kg-1，低于检出限0.03 µg·kg-1，符合《食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》（GB 5009.22—2016）。另取3份5 g阴性样品，各加0.5 ng黄曲霉毒素B1标准品，按相同步骤制备并测定，黄曲霉毒素B1的含量为0.098 µg·kg-1，该值低于规定的定量限0.1 µg·kg-1，与GB 5009.22—2016的要求相符合。

3 结论

本研究对样品净化步骤进行改良，将常规使用的PBS溶液替换为超纯水，省去氮吹这一原有步骤。经优化实验条件后，用于检测食用油中黄曲霉毒素B1。结果表明，目标峰呈现良好的形态，与杂峰之间可以实现清晰的分离，且干扰因素大大减少。该方法操作流程简单、检测速度快、试剂使用量少，为测定食用油中黄曲霉毒素B1的含量提供了更为高效的定性与定量分析方法。

参考文献

[1]黄良江.高效液相色谱非衍生法检测食用油中的黄曲霉毒素B1的含量[J].现代食品，2023，29（5）：220-223.

[2]叶雅真，骆和东，张淑琼，等.食用油中黄曲霉毒素B1快速检测试剂盒的质量评价[J].中国油脂，2022，47（2）：91-95.

[3]许妍妍，董宇.食用油中黄曲霉毒素B1含量的测定能力验证[J].安徽农业科学，2020，48（22）：185-186.

[4]曹晶晶，刘莹，王雅楠，等.全自动免疫磁珠法与免疫亲和柱法测定食用油中黄曲霉毒素B1的对比研究[J].粮油食品科技，2023，31（3）：153-158.

[5]莫星忧，何善廉，吕柏东，等.食用植物油中黄曲霉毒素B1检测质量控制方法研究[J].中国标准化，2024（13）：241-245.

作者简介：陈旭银（1985—），男，贵州遵义人，本科，助理工程师。研究方向：粮油检验。

通信作者：王化东（1977—），男，土家族，湖南张家界人，中专，助理工程师。研究方向：粮油检验。E-mail： 404516012qq@.com。