毛细管柱气相色谱内标法检测蒸馏白酒中甲醇和乙酸乙酯的含量

摘 要：目的：建立毛细管柱气相色谱内标法测定蒸馏白酒中甲醇和乙酸乙酯含量的方法。方法：以叔戊醇为内标物质，利用气相色谱-氢火焰离子化检测器和INNOWAX色谱柱对市售蒸馏白酒中的甲醇和乙酸乙酯进行检测，内标法定量。结果：通过优化色谱条件，甲醇和乙酸乙酯可以实现有效分离；两种物质与叔戊醇的浓度比在各自线性范围内线性关系良好，相关系数分别为0.999 9和0.999 5；在低、中、高3个加标水平下，两种样品的平均回收率在96.9%～99.4%，相对标准偏差在0.66%～2.03%。结论：该方法灵敏度好，准确性及分析效率高，适用于检测蒸馏白酒中甲醇和乙酸乙酯的含量。

关键词：气相色谱；蒸馏白酒；甲醇；乙酸乙酯

Determination of Methyl Alcohol and Ethyl Acetate in Distilled Baijiu by Capillary Column Gas Chromatography with Internal Standard

LI Yang， XIONG Wen， ZHANG Jie*

（Enshi Center for Disease Control and Prevention， Enshi 445000， China）

Abstract： Objective： To establish a capillary column gas chromatography internal standard method for the determination of methyl alcohol and ethyl acetate in distilled Baijiu. Method： Using tert-amyl alcohol as internal standard material， methanol and ethyl acetate in distilled Baijiu were determined by gas chromatography-hydrogen flame ionization detector and INNOWAX column. Result： By optimizing chromatographic conditions， methanol and ethyl acetate could be effectively separated; the concentration ratio between the two substances and tert-amyl alcohol had a good linear relationship in their respective linear ranges， and the correlation coefficients were 0.999 9 and 0.999 5， respectively; the average recoveries of the two samples were 96.9% to 99.4% and the relative standard deviations were 0.66% to 2.03% under the three levels of low， middle and high. Conclusion： The method has good sensitivity， high accuracy and high analytical efficiency， and is suitable for the determination of methyl alcohol and ethyl acetate in distilled Baijiu.

Keywords： gas chromatography; distilled Baijiu; methanol; ethyl acetate

我国酒文化历史悠久，其中蒸馏白酒凭借其独特的酿造工艺和风味，在中国饮食文化中占据重要地位。酿酒原料在白酒酿造过程中会生成以乙醇为主体，醇、酸、酯及醛等多种微量成分共存的复杂体系。甲醇作为白酒中影响消费者健康的醇类物质，具有强烈毒性，在人体内有蓄积作用[1]，对中枢神经系统和视神经有特殊选择作用，过量摄入会导致多种不适症状，如视力模糊（严重时可致失明）、呼吸功能障碍（严重时可致呼吸衰竭）等[2]。近年来，散装白酒的质量安全问题日益突出，因此对酒中甲醇含量进行准确定量检测显得尤为重要，而乙酸乙酯作为赋予白酒特殊香气的重要组成酯类，与甲醇和乙醇的沸点相近，高含量乙醇和乙酸乙酯在色谱图中响应值较大，甲醇峰容易与乙醇峰或乙酸乙酯峰重叠，导致目标峰分离不完全[3]，严重影响白酒中甲醇的准确定量检测。基于此，本文旨在优化色谱条件，建立一种测定蒸馏白酒中甲醇和乙酸乙酯含量的方法。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与试剂

白酒样为包谷酒（酒精度53%vol），市售。

GC-2030AF气相色谱仪（配备自动进样器、氢火焰离子化检测器），日本岛津公司；氮气、氢气（纯度均大于99.999%）；强极性石英毛细管色谱柱，SH-Rtx-Wax（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、SH-Rtx-Wax（60 m×0.25 mm，0.25μm）及HP-INNOWax（30 m×0.25 mm，0.25 μm）。

无水乙醇、甲醇、乙酸乙酯及叔戊醇，均为色谱纯；15种组分白酒标准溶液（ZKP3049-15），滕州中科谱分析仪器有限公司。

1.2 色谱条件

柱温箱升温程序：初始温度40 ℃保持3 min，以5 ℃·min-1升至130 ℃，再以20 ℃·min-1升温至200 ℃，保持5 min。进样口温度为250 ℃，柱流量为1.20 mL·min-1，分流比为70∶1，氢火焰离子化检测器温度为250 ℃，氢气和空气流速分别为35、350 mL·min-1，进样量为1.0 μL。

1.3 试剂及标准溶液的配制

（1）乙醇溶液（40%，V/V）：量取40 mL无水乙醇，纯水定容至100 mL，混匀。

（2）混合标准工作溶液（甲醇浓度为5 000 mg·L-1，乙酸乙酯浓度为6 000 mg·L-1）：分别准确称取0.250 g甲醇和0.300 g乙酸乙酯至50 mL容量瓶中，用乙醇溶液定溶至50 mL，混匀，于4 ℃冰箱中低温保存待用。

（3）叔戊醇标准溶液（7 506 mg·L-1）：准确称取0.375 3 g叔戊醇至50 mL容量瓶中，用乙醇溶液定溶至刻度线，混匀，于4 ℃冰箱中低温保存待用。

1.4 标准曲线的建立

分别准确吸取适量混合标准工作溶液于7个10 mL容量瓶中，用40%乙醇溶液（V/V）定容至刻度线，配制成不同质量浓度的混合标准系列溶液，混匀，分别取1.0 mL于进样瓶中，加入30 μL叔戊醇标准溶液，立即加盖密封后混匀，上机测定。

1.5 方法检出限和定量限

将装有995 μL乙醇溶液的20支进样小瓶分为2组，分别使用微量移液器和气密性注射器加入5 μL混合标准工作溶液和30 μL内标叔戊醇标准溶液，加盖密封后混匀，上机测定。

1.6 回收率和精密度

分别准确移取1.0 mL白酒样品于20支进样小瓶中，其中2支作为本底样品，其余18支分为3组，每组分别加入混合标准工作溶液20、40 μL和70 μL，最后各加入30 μL内标叔戊醇标准溶液，加盖密封混匀后，上机测定，计算各组的回收率和相对标准偏差。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 石英毛细管色谱柱的筛选及待测组分定性

甲醇和乙醇同为醇类物质，物理特性相似，导致二者分离难度较大[4]。采用长度、内径和固定相液膜厚度不同的强极性聚乙二醇石英毛细管柱，考察不同色谱柱对目标组分分离效果的影响。由图1可知，待测组分在不同色谱柱上出峰顺序无明显差异，当使用内径、膜厚度及固定相相同而长度不同的Rtx-Wax色谱柱时[图1（a）和图1（b）]，被分析物的保留时间随柱长度的增加而延长，目标物质分离效果均不理想，乙酸乙酯峰、甲醇峰完全重叠，甲醇与乙醇、叔戊醇与乙醇的分离度较差，出现峰形不对称和严重拖尾现象，直接影响甲醇、乙酸乙酯的准确定量；当使用内径较大、液膜较厚的INNOWAX色谱柱时，乙酸乙酯、甲醇、叔戊醇实现完全分离，峰形尖锐对称、分离度高、半峰宽、响应灵敏[图1（c）]。因此，最终选择HP-INNOWAX石英毛细管柱进行后续实验。

2.1.2 分流比的确定

分流比即为分流流量与色谱柱柱流量之比，适当的分流比可改善半峰宽及对称性，有效提高组分间的分离度[3]。保持其他色谱条件不变，分别设置分流比为20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、90∶1及100∶1，考察各目标物质的分离效果。不同分流比对保留时间、分离度、峰面积、半峰宽及理论塔板数的影响如表1所示。不同分流比下保留时间的相对标准偏差为0.93%，改变分流比对保留时间无明显影响，但可对组分分离度、峰面积、峰形及柱效产生一定程度影响。分流比越大，进入到色谱柱的样品量越小，峰面积逐渐变小，分流歧视影响增大，测定灵敏度降低；半峰宽随分流比的增加呈现变窄的趋势，但在（70∶1）～（100∶1）时变化不明显。因此，为避免分流比过小引起柱超载和溶剂拖尾遮掩目标峰，以及分流比过大导致分流歧视增大和分析灵敏度降低，最终选择分流比为70∶1进行后续实验。

2.1.3 初始温度优化结果及分析

色谱柱的初始温度既要保证待测组分完全分离，又要保证所有组分都能流出色谱柱，且应避免分析时间过长。通常，温度越低，低沸点物质分离度越好[5]。保持其他色谱条件不变，设置初始温度分别为30、35、40、45、50 ℃和55 ℃，考察不同初始温度对目标物质分离效果的影响。不同初始温度对保留时间、分离度、峰面积、半峰宽、理论塔板数的影响如表2所示。结果表明，不同初始温度对各组分保留时间、分离度、柱效及色谱峰峰形影响较大。初始温度越高，出峰越快，保留时间、分离度、理论塔板数变小，温度变化造成保留时间的重现性较差，从而影响待测组分的定性结果。虽然在较低温度下可改善低沸点化合物的分离度，但可能使已汽化的高沸点组分重新凝华导致组分损失和色谱柱污染，同时基于色谱柱的聚合物固定相在黏流状态下的传质阻力较小，容易获得较高的柱效，且INOWAX色谱柱的使用温度下限为40 ℃，因此选择初始温度为40 ℃进行后续实验。

2.1.4 初始温度保持时间

在气相色谱分析过程中，进入正式程序之前，于特定初始温度条件下对样品进行处理的时间长度至关重要。这段时间被称为初始温度保持时间，其直接影响到后续步骤中甲醇、酯类等成分的分离效果。若该时间段过短，则可能导致某些关键组分，如丙酸乙酯无法从溶剂峰中被清晰地分辨出来[5]。保持其他色谱参数不变，设置初始温度保持时间分别为1、2、3、4、6 min和8 min，考察不同初始温度保持时间对最终检测结果的影响。结果表明，适当增加初始温度保持时间有助于提高各色谱峰的分辨率，且不会显著改变目标化合物的响应强度（峰面积）。随着保持时间的增加，各目标峰可以获得较好的分离效果，但同时各色谱峰出现半峰宽增加、峰高降低以及理论塔板数减少的现象，导致分析时间也随之延长。综合考虑，选择初始温度保持时间为3 min进行后续实验。

2.1.5 升温速率

升温速率是影响气相色谱分离效果和分析效率的重要因素之一。随着升温速率的减小，分离度增大，但当升温速率超过某一阈值后，分离度开始下降[6]。设置一阶升温速率分别为4、5、8、12 ℃·min-1，考察升温速率对分离效果的影响。不同升温速率对各组分分离效果和效率的影响如图2所示。较慢的升温速率（如4 ℃·min-1和5 ℃·min-1），有助于体系接近平衡条件，使相邻两峰更好地分离，从而提高分辨率。然而，这种条件下样品的测定时间较长，且对仪器灵敏度要求较高。升温速率越快，各组分在较短时间内集中出峰，整体色谱峰的保留时间缩短，理论塔板数变大，分析效率提升，但甲醇、乙酸乙酯等化合物峰的分离度降低，导致部分组分不能完全分离。当升温速率为8 ℃·min-1和12 ℃·min-1时，可能会导致某些组分的分离度显著下降，甚至发生峰的重叠，进而影响色谱图的清晰度及结果的准确性。因此，最终选择升温速率为5 ℃·min-1进行后续实验。