玫瑰发酵液的制备及其生物活性的探究

摘 要：本文利用植物乳植杆菌发酵制备不同发酵时间的玫瑰发酵液，并对其总多糖、总酚、超氧化物歧化酶、总酸、DPPH自由基清除率、羟自由基清除率以及酪氨酸酶活性抑制率等指标进行测定。结果表明，玫瑰发酵液的最佳发酵时间为30 h。在此条件下，发酵液的总多糖含量为0.319 mg·mL-1，总酚含量为73.153 μg·mL-1，超氧化物歧化酶酶活力为14.130 U·mL-1，总酸含量为0.012 6 g·kg-1。玫瑰发酵液的浓度为1%、5%、10%时，对DPPH自由基的清除率分别为80.769%、85.452%、85.618%；对羟自由基的清除率分别为82.818%、87.972%、91.924%；对酪氨酸酶的活性抑制率分别为78.800%、82.800%、107.200%。结果显示，玫瑰发酵液具备较好的抗氧化能力和生物活性。

关键词：玫瑰；发酵；植物乳植杆菌；生物活性

Study on the Preparation and Biological Activity of Rose Fermentation Liquid

YAO Jiawei1， LI Muyuan2， NIE Yutong3， YAO Aibing1， LI Jinxin2*

（1.Ningxia Jiahe Huayu Ecological Agriculture Co.， Ltd.， Shizuishan 753000， China; 2.Ningxia University， Yinchuan 750021， China; 3.Qufu Normal University， Jining 273100， China）

Abstract： In this paper， the fermentation liquid of rose with different fermentation time was prepared by the fermentation of Lactiplantibacillus plantarum， and its total polysaccharide， total phenol， superoxide dismutase， total acid， DPPH free radical scavenging rate， hydroxyl free radical scavenging rate and tyrosinase activity inhibition rate were measured. The results showed that the optimum fermentation time of rose fermentation liquid was 30 h. Under these conditions， the total polysaccharide， total phenol content， superoxide dismutase activity and total acid content were 0.319 mg·mL-1， 73.153 μg·mL-1， 14.130 U·mL-1 and 0.012 6 g·kg-1 respectively. When the concentration of rose fermentation liquid was 1%， 5% and 10%， the scavenging rates of DPPH free radicals were 80.769%， 85.452% and 85.618%， respectively. The scavenging rates of hydroxyl free radicals were 82.818%， 87.972% and 91.924%， respectively. The inhibition rates of tyrosinase activity were 78.800%， 82.800% and 107.200%， respectively. The results showed that rose fermentation liquid had better antioxidant capacity and biological activity.

Keywords： rose; fermentation; Lactiplantibacillus; bioactivity

玫瑰是一种具有重要经济价值，集药用、食用、绿化和美化等多种功能于一体的木本植物[1]。成熟的玫瑰花瓣中含有大量的芳香油、氨基酸、维生素、可溶性糖、酚类化合物及生物碱[2]，在食品工业中用途广泛[3]。当前，通过生物发酵技术，可以生产加工玫瑰酒[4]、玫瑰醋[5]和玫瑰饮料[6]等。利用微生物进行发酵，可以将玫瑰花瓣中丰富的营养成分转化为更易于吸收的形式，并且可能产生新的生物活性物质[7]。李涛涛[8]研究发现，益生菌发酵玫瑰花瓣能够显著提高没食子酸、槲皮素、对香豆酸等单体酚的含量，并检测到绿原酸。赵丹等[9]研究发现，经酿酒酵母发酵后的玫瑰发酵液具有清除DPPH自由基的能力，并能显著抑制酪氨酸酶活性，为其在美白功效食品中的应用提供科学依据。国内的研究主要集中在利用不同的微生物进行玫瑰花瓣的发酵，如酵母菌、乳酸菌和霉菌等[10]。研究发现，不同的微生物可以对玫瑰发酵液的成分和风味产生显著影响[11]。发酵过程能够提高玫瑰中的多酚类化合物和抗氧化活性的生物利用度[12]。例如，一些研究表明，发酵可以促进玫瑰花青素的释放，从而增强其抗氧化能力[13]。

本文通过植物乳植杆菌发酵制备不同发酵时间的玫瑰发酵液，并对其总多糖、总酚、超氧化物歧化酶、总酸、DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率以及酪氨酸酶活性抑制率等指标进行测定，为其在食品中的应用提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

玫瑰花瓣、去离子水、植物乳植杆菌，善恩康生物科技（宿州）有限公司；DPPH（1，1-二苯基-2-苦基肼）（纯度为98%）、甲醇（分析纯）、乙醇（分析纯）、邻苯二酚、磷酸缓冲溶液、水杨酸、硫酸亚铁、过氧化氢、酚酞指示剂、氢氧化钠、DNS试剂、盐酸溶液、葡萄糖、没食子酸、福林酚试剂、碳酸钙、总超氧化物歧化酶测试盒、熊果苷、维生素C和酪氨酸酶。

BSA224S分析天平；L6s紫外分光光度计；酶标仪；正压过滤器；ST16R冷冻离心机；数显恒温水浴锅；鼓风干燥箱；可调式电炉；50 mL滴定管，天玻A级；ZQWY-218N型恒温振荡培养箱；QL-902涡旋振荡仪；ZDJ-4A自动电位滴定仪；E-201-C-65 pH复合电极；PB-10 pH计。

1.2 实验方法

1.2.1 玫瑰发酵液的制备

取2.0%玫瑰干粉、3.0%葡萄糖与一定量去离子水于烧杯中混匀，置于121.0 ℃条件下，灭菌25 min。取出后冷却至室温，获得发酵培养液。在无菌条件下，取30.0 mg植物乳植杆菌接种到发酵培养液中，在摇床（40.0 ℃）中进行振荡培养，以获得玫瑰发酵产物；然后将该产物在85.0 ℃下灭菌30 min，冷却。将灭活后的玫瑰发酵液以10 000 r·min-1离心10 min，除去菌体，收集上清；再使用0.45 μm滤膜进一步除去残留。将最终得到的上清液，置于80.0 ℃水浴锅中灭菌20 min，冷却。通过上述方法制作发酵时间分别为6、12、18、24、30 h和36 h的玫瑰发酵液。

1.2.2 玫瑰发酵液总多糖含量测定

发酵液总多糖待测样的制备参照王鹏亭等[14]、曾志恒等[15]方法进行改良。用移液管精密吸取不同发酵时间的玫瑰发酵液6 mL，置于25 mL容量瓶中，加入6 mol·L-1的HCl溶液6 mL，封口，置于消解仪中，100.0 ℃加热30 min，冷却至室温，加2～3滴酚酞指示剂，用6 mol·L-1 NaOH溶液滴定至溶液初显淡红色，加水定容至25 mL，摇匀，即得发酵液总多糖待测样。

精密移取制备的待测样5.0 mL于50 mL容量瓶中，并定容至刻度线。精密移取稀释后的发酵液总多糖待测样2.0 mL于25 mL容量瓶中，补水至5.0 mL，加入DNS试剂5.0 mL，混匀，沸水加热5 min，冷却至室温，定容至25 mL，去离子水为空白，于540 nm处测定吸光度，计算不同发酵时间的发酵液中的总多糖含量。

1.2.3 玫瑰发酵液总酚含量测定

采用Folin-Ciocalteu法测定总酚含量。参照LANG等[16]的方法，分别取16 μL不同发酵时间的发酵液与50 μL福林酚试剂混合在96孔板中，在室温下避光反应2 min，随后加入50 μL 10%的碳酸钙溶液，在25.0 ℃水浴中加热1 h，最后测定其在765 nm处的吸光度。以没食子酸作为标准品计算总酚含量。

1.2.4 玫瑰发酵液超氧化物歧化酶酶活力测定

在离心管内加入生理盐水2 mL，分别缓慢加入玫瑰发酵液1 mL，共3 mL，置于涡旋振荡仪上涡旋混匀。离心后取上清液，重复离心一次，上清液即为超氧化物歧化酶粗提液。

采用羟胺法测定超氧化物歧化酶活性，具体测定方法参照总超氧化物歧化酶测试盒说明书进行[17]。超氧化物歧化酶酶活力的计算公式为

（1）

式中：A0为对照管吸光度；A1为管吸光度；Dx为反应体系稀释倍数；D0为样品测试前稀释倍数。

1.2.5 玫瑰发酵液总酸含量测定

为避免二氧化碳对总酸测定的干扰，将煮沸后的蒸馏水作为溶剂通过空白实验消除CO2干扰[18]。分别取25 mL蒸馏水于150 mL锥形瓶中，加入2～3滴0.2%的酚酞指示剂，用0.01 mol·L-1 NaOH标准溶液进行滴定，观察溶液由无色变为粉红色，且30 s内不褪色，即为终点，记录滴定体积。使用0.2%的酚酞为指示剂，用0.01 mol·mL-1 NaOH标准溶液滴定，观察由黄色变为橙红色，且30 s内不褪色，记录滴定体积，从而计算玫瑰发酵液的总滴定酸度。

1.2.6 玫瑰发酵液抗氧化能力测定

采用DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）评估玫瑰发酵液的抗氧化活性，参考LEKOUAGHET等[19]的方法。用移液枪准确取80 μL的玫瑰发酵液（30 h）于96孔板中，加入DPPH溶液，并用甲醇稀释至200 μL，充分混合后在避光条件下反应30 min。最后在517 nm处测定吸光度，计算DPPH自由基清除率。DPPH自由基清除率的计算公式为

（2）

式中：A0为甲醇与DPPH溶液的吸光度；A1为玫瑰发酵液与DPPH溶液的吸光度；A2为玫瑰发酵液样品与甲醇的吸光度。

羟基自由基清除实验。利用水杨酸法，在510 nm测定玫瑰发酵液的羟基自由基清除能力。羟基自由基清除率的计算公式为

（3）

式中：A0为空白对照的吸光度；Ax为待测物质组的吸光度；Ax0为待测样背景组的吸光度（OD510 nm）。

1.2.7 玫瑰发酵液酪氨酸酶活性抑制的测定

酪氨酸酶是生物体内合成黑色素的重要酶，抑制其活性可间接减少黑色素的合成，从而实现美白效果。实验设置了样品组和对照组（熊果苷）。使用pH=6.8的磷酸盐缓冲液，配制成酶活力为60 U·mL-1的酪氨酸酶以及浓度为0.1 mg·mL-1的L-酪氨酸。反应体系在96孔板中的总容量为200 μL，包括L-酪氨酸40 μL、酪氨酸酶溶液40 μL、缓冲液和待测样品溶液共120 μL。玫瑰发酵液终浓度为1%、5%、10%，对应加入玫瑰发酵液为2、10、20 μL，缓冲液为118、110、100 μL。总体系为200 μL，L-酪氨酸40 μL、酪氨酸酶溶液40 μL。将酶标仪检测系统设置为温度37 ℃，将待测的96孔板迅速放在酶标仪检测系统，测定475 nm处的吸光度，每2 min检测1次，持续40 min。