高效液相色谱法测定酱油中苯甲酸含量的测量不确定度评定

高效液相色谱法测定酱油中苯甲酸含量的测量不确定度评定0

摘要：本文采用高效液相色谱法检测酱油中苯甲酸含量并进行测量不确定度评定。结果表明，在95%置信水平下，当酱油中苯甲酸含量为0.385 g·kg-1时，扩展测量不确定度为0.022 0 g·kg-1（k=2）。酱油中苯甲酸含量测量不确定度的主要贡献为分析仪器、工作曲线的拟合、苯甲酸标准溶液和苯甲酸标准系列溶液配制。

关键词：高效液相色谱法；酱油；苯甲酸；不确定度

Uncertainty Evaluation for Determining Benzoic Acid in Sauce by High Performance Liquid Chromatography

YAN Kaiqin， TAN Rongwei， ZENG Xiaoping， XIANG Junyi， ZHENG Xuezhi， TAN Zhilei

（Qingyuan Food Inspection Center， Qingyuan 511500， China）

Abstract： This article uses high-performance liquid chromatography to detect the content of benzoic acid in soy sauce and evaluate the measurement uncertainty. The results showed that at a 95% confidence level， when the benzoic acid content in soy sauce was 0.385 g·kg-1， the extended measurement uncertainty was 0.022 0 g·kg-1 （k=2）. The main contributions to the measurement uncertainty of benzoic acid content in soy sauce are analytical instruments， fitting of working curves， benzoic acid standard solutions， and preparation of benzoic acid standard series solutions.

Keywords： high performance liquid chromatography; sauce; benzoic acid; uncertainty

苯甲酸及其钠盐具有抑制霉菌、酵母和细菌的作用，可预防食品腐败变质。常以苯甲酸钠的形式广泛用于酱油、酱腌菜、蜜饯和饮料等食品中。研究表明，正常剂量的苯甲酸不会对人体健康造成影响，但是长期且过量摄入苯甲酸含量超标的食品可能会对人体肝脏和肾脏以及胃产生危害[1]。《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）[2]明确规定了酱油中苯甲酸的最大使用量，但一些不法企业为了在生产经营中牟取利益，超限量使用苯甲酸。因此，准确测量酱油中苯甲酸的含量至关重要。本实验参照《食品安全国家标准食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》（GB 5009.28—2016）[3]对酱油中的苯甲酸进行检测，根据《化学分析中不确定度的评估指南》（CNAS—GL006：2019）[4]和《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）[5]分析评定液相色谱法测定酱油中苯甲酸含量的不确定度，以期提升酱油中苯甲酸含量测定的检测方法和结果的准确度和可信度。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

酱油样品，由政府抽检提供；苯甲酸标准溶液（1 000 μg·mL-1），中国计量科学研究院；亚铁氰化钾（分析纯）、乙酸锌（分析纯）、甲醇（色谱纯）和乙酸铵（分析纯）。

高效液相色谱仪（LC-20A，配有PDA检测器）、电子天平（HR-250AZ）。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制

精密吸取苯甲酸标准溶液（1 000 μg·mL-1）10 mL于50 mL容量瓶（A级）中，用水定容，得到苯甲酸标准中间液（200 μg·mL-1）。分别精密吸取苯甲酸中间液0.05、0.15、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、4.00 mL和5.00 mL于10 mL容量瓶，用水定容，配制成质量浓度分别为1、3、5、10、20、30、40、50、60、80 μg·mL-1和100 μg·mL-1的标准系列工作溶液，临用现配。

1.2.2 样品前处理

精密称量约2 g酱油样品，放入50 mL离心管中，加入约25 mL一级水，振荡混匀，在50 ℃水浴下，超声提取20 min，自然冷却到室温状态后，加入2 mL亚铁氰化钾水溶液和2 mL乙酸锌水溶液，摇匀后，以8 000 r·min-1离心5 min，将上清液转入50 mL容量瓶中，继续向残渣中加入约20 mL一级水重复提取1次，将上清液转入上述50 mL容量瓶中，用一级水定容，摇匀。取部分上清液经0.22 μm滤膜过滤后上机测定。

1.2.3 仪器条件

色谱柱：Syncronis C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相组分：甲醇∶0.02 mol·L-1醋酸铵水溶液（5∶95，V/V）；流动相流速：1 mL·min-1；波长：230 nm；进样量：10 μL。

1.3 建立测量模型

建立酱油中苯甲酸含量测定的测量模型，计算公式为

（1）

式中：X为试样中待测物含量，g·kg-1；C为试样中待测物浓度，μg·mL-1；V为试样定容体积，mL；m为称样量，g；1 000为换算系数。

2 结果与分析

2.1 不确定度来源分析

本方法测量不确定度来源主要有以下7个方面：试样称量ur（m）；试样定容ur（V1）；苯甲酸标准溶液ur（B）；苯甲酸标准曲线系列溶液配制ur（Vs）；工作曲线的拟合ur（C）；分析仪器ur（A）；重复性测定试样ur（P）。其中试样定容和制备苯甲酸标准曲线系列溶液的测量不确定度主要由两个方面组成：量具体积校正；操作温度与量具体积校正温度的温差。

2.2 试样称量引入的相对标准测量不确定度

天平称量样品的平均质量为2.035 6 g，由电子天平校准证书得到扩展测量不确定度为0.2 mg，包含因子为k=2，因此试样称量引入的相对标准测量不确定度为

2.3 试样定容引入的相对标准测量不确定度

本实验上清液定容使用的量具为50 mL的容量瓶（A级）。依据《常用玻璃量器》（JJG 196—2006）[6]，50 mL的A级容量瓶20 ℃时，容量允差为±0.05 mL，按三角分布，计算该量具体积校正产生的标准测量不确定度为

操作温度与量具体积校正温度温差为±5 ℃，水的膨胀系数为2.1×10-4 ℃-1，按均匀分布，计算温差产生的标准测量不确定度为

综合以上，得到试样定容产生的相对标准测量不确定度为

2.4 苯甲酸标准溶液引入的相对标准测量不确定度

由标准物质证书得到苯甲酸标准溶液的相对扩展测量不确定度为1%（包含因子k=2），则苯甲酸标准溶液产生的相对标准测量不确定度为

2.5 苯甲酸标准系列溶液配制引入的相对标准测量不确定度

在苯甲酸标准系列溶液的配制过程中，用10 mL A级移液管移取苯甲酸标准溶液，用50 mL A级容量瓶对标准溶液稀释定容得到200 μg·mL-1苯甲酸中间液；用1、5 mL A级分度移液管分别移取苯甲酸中间液获得不同浓度的苯甲酸标准系列溶液，用10 mL A级容量瓶对系列溶液定容。

（1）10 mL移液管产生的相对标准测量不确定度。移取苯甲酸标准溶液的量具为10 mL分度移液管（A级），查得容量允差为±0.05 mL，按三角分布计算该量具体积校正产生的标准测量不确定度为