食品中黑果腺肋花楸提取物花色苷的测定

摘 要：建立超高效液相色谱法（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC）测定黑果腺肋花楸果产品中花色苷含量。样品经90%甲醇-2%盐酸溶液超声萃取，经0.22 μm微孔滤膜过滤后用超高效液相色谱仪-紫外检测器分析。选用色谱柱UPLC BEH C18，流动相A：甲醇∶乙腈∶甲酸∶水体积比为2∶2∶1∶5，流动相B：10%甲酸水溶液；流速为0.4 mL·min-1；进样体积为5 μL；柱温为室温；运行时间为10 min。矢车菊素-3-半乳糖苷和矢车菊素-3-阿拉伯糖苷在标准曲线浓度范围内线性关系良好，回收率均大于90%。本方法简单，检测灵敏度高，稳定性好，适用于食品样品中黑果腺肋花楸果中花色苷含量的检测。

关键词：超高效液相色谱法（UPLC）；矢车菊素-3-半乳糖苷；矢车菊素-3-阿拉伯糖苷

Determination of Anthocyanin Extract of Aronia melanocarpa in Food

WU Shaomin， LI Yuzhen， YANG Jing， CHEN Hanfeng

（Access （Guangzhou） Testing Technology Service Co.， Ltd.， Guangzhou 510730， China）

Abstract： To establish a method for the determination of anthocyanins in Aronia melanocarpa in food by ultra performance liquid chromatography （UPLC）. The sample was extracted by ultrasound with 90% methanol-2% hydrochloride acid solution. It was filtered through a 0.22 μm microporous filter membrane and analyzed using UPLC with UV detector. Select a chromatography column UPLC BEH C18， with a mobile phase A of methanol∶acetonitrile∶ormic acid∶water volume ratio of 2∶2∶1∶5， mobile phase B of 10% formic acid; the flow rate was 0.4 mL·min-1; the injection volume was 5 μL; the column temperature was room temperature; the running time was 10 minutes. The linear relationship of cyanidin-3-galactoside and cyanidin-3-arabinosside within the concentration range of the standard curve was good and recovery rates greater than 90%. This method is simple， with high sensitivity and good stability. It is suitable for the detection of anthocyanins content of Aronia melanocarpa in food samples.

Keywords： ultra performance liquid chromatography （UPLC）; cyanidin-3-galactoside; cyanidin-3-arabinosside

黑果腺肋花楸[Aronia melanocarpa （Michx.） Elliott]，别名野樱莓，入药部位为果实[1]，具有抗氧化、清除自由基、抗炎、抗肿瘤、抗病毒、降血糖以及抗辐射等作用[2-6]。黑果腺肋花楸于2018年9月被国家卫生健康委员会批准为新食品原料，每日使用量≤10 g·d-1（以鲜品计）。但目前并无统一、具体、规范、明确的质量控制标准，这对于黑果腺肋花楸产品的开发与推广造成很大障碍。

所有浆果中，黑果腺肋花楸果中花色苷含量最高[7]。黑果腺肋花楸果中绝大部分的花色苷为矢车菊素的糖苷衍生物（占总花色苷9.0%～98.7%）。相关研究[8]得出主要的4种花色苷及占比为矢车菊素-3-半乳糖苷（68.68%）、矢车菊素-3-阿拉伯糖苷（25.62%）、矢车菊素-3-葡萄糖苷（5.28%）、矢车菊素-3-木糖苷（0.42%）。因此，本文选取占比高的矢车菊素-3-半乳糖苷和矢车菊素-3-阿拉伯糖苷作为目标物进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

含有黑果腺肋花楸果的粉末样品A（市售），不含有黑果腺肋花楸果的粉末阴性样品B（市售）。

甲醇（默克，色谱纯）；乙腈（默克，色谱纯）；甲酸（默克，色谱纯）；盐酸（分析纯，广州试剂厂）；矢车菊素-3-半乳糖苷标准品（上海诗丹德）；矢车菊素-3-阿拉伯糖苷标准品（上海诗丹德）。水为符合《分析实验室用水规格和试验方法》（GB/T 6682—2008）规定的一级水。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪配紫外检测器，沃特世；UPLC BEH C18液相色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），沃特世公司；分析天平（感量0.1 mg），梅特勒-托利多公司；超声波振荡器（S180H），艾尔玛公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标准品溶液的配制

分别称取矢车菊素-3-半乳糖苷14.59 mg（纯度92.16%）和矢车菊素-3-阿拉伯糖苷12.38 mg（纯度96.60%）至10 mL容量瓶，用90%甲醇-2%盐酸溶解并定容，为标准储备液。

准确移取矢车菊素-3-半乳糖苷标准储备液1 mL和矢车菊素-3-阿拉伯糖苷标准储备液1 mL至10 mL容量瓶中，用10%甲酸水定容并摇匀，制得中间储备液。

准确移取中间储备液0.1、0.2、0.4、0.8 mL和1.6 mL至10 mL容量瓶中用10%甲酸水定容摇匀。制备成矢车菊素-3-半乳糖苷浓度为1.344 6、2.689 2、5.378 4、10.756 8 µg·mL-1和21.513 6 µg·mL-1以及矢车菊素-3-阿拉伯糖苷浓度为1.196 0、2.392 0、4.784 0、9.568 0 µg·mL-1和19.136 0 µg·mL-1的系列标准溶液。

1.3.2 样品前处理

准确称取样品5.0 g至离心管，加入30 mL 90%甲醇-2%盐酸溶液，放入超声波振荡器中超声提取30 min，放置室温后用90%甲醇-2%盐酸溶液定容至50 mL容量瓶；移取1 mL至10 mL容量瓶中，用10%甲酸水溶液摇匀定容，经0.22 µm微孔滤膜过滤至样品瓶，供液相色谱测定。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：UPLC BEH C18液相色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相A：甲醇∶乙腈∶甲酸∶水体积比为2∶2∶1∶5；流动相B：10%甲酸水；流速：0.4 mL·min-1；进样体积：5 μL；柱温：室温；运行时间：10 min。洗脱程序详见表1。

2 结果与分析

2.1 提取液选择

目前花色苷的提取试剂主要是甲醇、乙醇、水，由于花色苷分子中3，5，7-三羟基-2-苯基苯并吡喃的母核结构，其在酸性水溶液中以稳定的黄烊盐阳离子存在，而在碱性条件下以结构不稳定的蓝色醌式碱形式存在，因此常在提取试剂中加入盐酸以提高花色苷的稳定性。提取后再稀释至合适浓度上机。本研究考察不同浓度的提取液对矢车菊素-3-阿拉伯糖苷的提取效果，结果发现采用90%甲醇-2%盐酸溶液提取最为理想（图1）。同理，矢车菊素-3-半乳糖苷也是采用90%甲醇-2%盐酸溶液提取最为理想。

2.2 色谱柱选择

分别采用UPLC HSS SB C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）、UPLC HSS C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）和UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）3种色谱柱对同一标准溶液（9.568 0 µg·mL-1矢车菊素-3-阿拉伯糖苷和10.756 8 µg·mL-1矢车菊素-3-半乳糖苷混标溶液）和样品A进行上机分析。

采用UPLC HSS SB C18和UPLC HSS C18对标准溶液进行分析的色谱图如图2（a）和图2（b）所示，标准品色谱峰分离不开。采用UPLC BEH C18色谱柱对标准品和样品A进行分析的色谱图如图2（c）和图2（d）所示，标准品及样品峰型较好，样品峰与杂峰已彻底分离。故本方法采用UPLC BEH C18色谱柱作为分析柱。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系

选取1.344 6、2.689 2、5.378 4、10.756 8 µg·mL-1和21.513 6 µg·mL-1的矢车菊素-3-半乳糖苷以及1.196 0、2.392 0、4.784 0、9.568 0 µg·mL-1以及19.136 0 µg·mL-1矢车菊素-3-阿拉伯糖苷工作溶液按照优化好的最佳色谱条件进行测定，绘制标准曲线，进行线性回归分析（图3）。矢车菊素-3-半乳糖苷线性回归方程为y=42 133x-1 078，相关系数R2=0.999 8。矢车菊素-3-阿拉伯苷线性回归方程为y=43 442x-2 903.3，相关系数R2=0.999 9。

2.3.2 专属性

检查阴性样品B溶液对结果是否存在干扰。如图4所示，阴性样品B在目标峰位置没有出现明显定量峰，不影响矢车菊素-3-半乳糖苷（保留时间约为3.46 min）和矢车菊素-3-阿拉伯糖苷（保留时间约为4.67 min）的定量。

2.3.3 溶液稳定性

将浓度为4.033 8 µg·mL-1的矢车菊素-3-半乳糖苷和2.392 0 µg·mL-1矢车菊素-3-阿拉伯糖苷对照品工作溶液和样品溶液分别在放置一定时间后测定，考察目标组分峰面积的变化，结果如表2所示。

由表2可见，对照品和样品A在12 h内峰面积变化较小，峰面积的相对偏差在2%以内，并无新的杂质峰出现，样品A溶液在12 h内比较稳定。

2.3.4 检出限及定量限

在信噪比为3时得到矢车菊素-3-半乳糖苷检出限为7.5 µg·g-1，矢车菊素-3-阿拉伯糖苷检出限为5.5 µg·g-1。当S/N＞10时，得到矢车菊素-3-半乳糖苷定量限25.0 µg·g-1，矢车菊素-3-阿拉伯糖苷定量限18.2 µg·g-1。

2.3.5 精密度

两个分析员分别连续测定按规定浓度配制的6份样品A，计算12个测定结果的相对标准偏差，结果如表3所示。由表3可知，矢车菊素-3-半乳糖苷和矢车菊素-3-阿拉伯糖苷的RSD分别为3.11%和3.43%，方法重复性好。

2.3.6 准确度

每个加标水平进行3次平行检测，计算加标回收率（本底值为精密度测试中12个测定结果的平均值）。由表4可知，9个加标样矢车菊素-3-半乳糖苷的回收率在103.80%～111.78%，矢车菊素-3-阿拉伯糖苷的回收率在101.01%～105.55%。