基于免疫层析技术检测热带水果中典型农药残留的研究

摘 要：胶体金免疫层析快速检测卡测定农药残留具有操作简单、针对性强、成本低和便于携带等优点。本文通过胶体金免疫层析法与液相-质谱联用法检测热带水果（香蕉、芒果）中的苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯、吡虫啉、噻虫胺和噻虫嗪5种农药并进行结果对比分析，对胶体金免疫层析速测卡准确性和灵敏度进行确证。结果表明，胶体金免疫层析速测卡检测热带水果中的农药残留与液相质谱联用法检测结果基本一致，具有较好的准确性和灵敏度。

关键词：免疫层析技术；热带水果；快速检测

Study on Detection of Typical Pesticide Residues in Tropical Fruits Based on Immunochromatography

KANG Rui1，2， GU Mantun1，2， ZHOU Ying1，2， GUO Xiaoyu1，2， LIU Chaofeng1，2， WANG Bin1，2*

（1.Institute of Food Testing，Hainan Academy of Inspection， Haikou 570314， China; 2.Key Laboratory of Tropical Fruits and Vegetables Quality and Safety， State Administration for Market Regulation， Haikou 570314， China）

Abstract： The rapid detection card of colloidal gold immunochromatography has the advantages of simple operation， strong pertinence， low cost and portability. In this paper， the colloidal gold immunochromatography combined with liquid chromatography-mass spectrometry was used to detect difenoconazole， pyraclostrobin， imidacloprid， clothianidin and thiamethoxam in tropical fruits （bananas and mangoes）， and the accuracy and sensitivity of the colloidal gold immunochromatography rapid test card were confirmed. The results showed that the detection of pesticide residues in tropical fruits by colloidal gold immunochromatographic rapid detection card was basically consistent with that by liquid chromatography-mass spectrometry， with good accuracy and sensitivity.

Keywords： immunochromatographytechnology; tropical fruits; rapid detection

海南省是我国热带水果重要种植生产基地。全省热带水果种植面积208 000 hm2，年产量412万t[1]。近年来，海南香蕉、芒果、荔枝等特色热带水果持续走向海外，品牌效益逐渐彰显。据海口海关统计，2023年海南省出口热带水果贸易额高达3 677万元，同比增长2.4倍，产品远销美国、欧盟、日本、新加坡等国际市场[2]。

受气候环境以及种植技术等因素影响，热带水果难免受到病虫害的侵袭，农药是主要的防治手段[3]。门雪等[4]对102批次热带水果样品进行了筛查和定量检测，芒果样品筛查出的农药主要为苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯、噻虫胺和吡虫啉，香蕉样品筛查出的农药主要为吡唑醚菌酯、吡虫啉、咪鲜胺、噻虫胺和噻虫嗪等。农药残留问题不仅影响消费者的身体健康，还严重影响我国热带农产品行业的发展。

目前，农药残留快速检测方法主要有酶抑制率法、酶联免疫法和胶体金免疫层析法等。酶抑制率法只能用于检测有机磷和氨基甲酸酯类农药，且两大类农药均对其酶有抑制反应，专一性不强，灵敏度不高[5-6]；酶联免疫法操作烦琐，检测时间长，需要专用仪器[7]。胶体金免疫层析法具有操作简单、成本低、便于携带以及抗干扰能力强等特点[8]，被广泛用于检验检测领域。因此，本研究拟应用胶体金免疫层析快速检测卡与液相质谱联用仪同时检测热带水果（以香蕉、芒果为例）中5种高风险农药残留（苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯、吡虫啉、噻虫胺和噻虫嗪），并对结果进行比对分析，以验证胶体金免疫层析法检测热带水果中农药残留的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

香蕉、芒果采购于海南省海口市农贸市场、超市。

吡唑醚菌酯快速检测卡、吡虫啉快速检测卡、噻虫胺快速检测卡、噻虫嗪快速检测卡和苯醚甲环唑快速检测卡，广州食源生物科技有限公司；甲酸、甲酸铵（质谱级），美国ACS恩科化学；甲醇、乙腈（质谱级），默克股份两合公司；实验室用水，由Milli-Q超纯水系统制备；对照品：吡唑醚菌酯、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪和苯醚甲环唑，纯度均＞98%，德国Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 仪器与设备

TQ-S液相-质谱联用仪，美国Waters公司；XS205、XS204电子天平，美国梅特勒公司；涡旋振荡器，德国海道尔夫公司；Centrifuge5804离心机，德国艾本德股份公司；移液枪200 μL、1 mL、

5 mL，德国BRAND公司。

1.3 溶液配制

（1）标准储备液（1 mg·mL-1）配制。精密称取吡唑醚菌酯、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪和苯醚甲环唑

5种农药标准品各10 mg（精确至0.1 mg），分别置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇或乙腈溶解并定容至刻度，配制成浓度为1 mg·mL-1的标准储备液。

（2）混合标准工作溶液（10 μg·mL-1）配制。分别精密吸取标准储备液1 mL于100 mL容量瓶中，乙腈定容至刻度，配制成浓度为10 μg·mL-1的混合标准工作溶液。

（3）基质混合标准系列溶液（2～500 ng·mL-1）配制。精密吸取混合标准工作溶液适量，分别用香蕉、芒果两种空白基质溶液稀释，配制成浓度为2、5、10、20、50、100、200 ng·mL-1和500 ng·mL-1的基质混合标准系列溶液。

1.4 检测方法

1.4.1 胶体金免疫层析法

（1）样品前处理。分别称取2 g香蕉、芒果样品至15 mL离心管中，加入4 mL提取液，涡旋振荡2 min，8 000 r·min-1离心5 min，上清液待用，根据《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》（GB 2763—2021）[9]中不同样品和项目的限值要求，对样品提取液进行稀释，得到待测液，具体稀释方法见表1。从铝箔袋中取出快速检测卡。用移液枪吸取上述待测液100 μL于样品孔中，反应10 min，判读结果。

（2）结果判定。胶体金免疫层析试纸条应用了竞争抑制免疫层析的原理，胶体金标记的特异性单克隆抗体吸附在金标垫上，BSA耦合物和二抗分别以条带状固定在NC膜的T线和C线上。当样品提取液滴加到样品垫后，通过毛细作用向前移动，样品中的农药与胶体金标记的抗体结合，抑制了抗体与T线上的BSA耦合物结合，从而引起检测线T线和控制线C线颜色的变化。通过肉眼观察T线和C线的显色结果，对样品进行定性判定，如图1所示。含量在检测限之内的为阴性（-），超出检测限的为阳性（+）。

1.4.2 液相色谱-质谱联用法

（1）样品前处理。香蕉、芒果中苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯、吡虫啉、噻虫胺和噻虫嗪等5种农药残留的前处理参照《食品安全国家标准 植物源性食品中331种农药及其代谢物残留量的测定 液相色谱—质谱联用法》（GB 23200.121—2021）[10]。

（2）色谱条件。色谱柱：Waters ACQUITY UPLC® HSS T3色谱柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）；柱温：35 ℃；进样量：1 μL；流动相：A为2 mmol·L-1甲酸铵-0.01%甲酸水溶液，B为2 mmol·L-1甲酸铵-0.01%甲酸甲醇溶液；流速：0.3 mL·min-1；洗脱方式：梯度洗脱；洗脱程序：0～0.50 min，3%B；0.50～7.00 min，98%B；7.00～8.80 min，98%B；8.80～9.00 min，3%B；9.00～10.00 min，3%B。

（3）质谱条件。离子源类型：电离喷雾离子源；扫描模式：多反应监测；离子源温度：150 ℃；毛细管电压：0.5 kV；干燥温度：350 ℃；干燥气：氮气；氮气气体流量：800 L·h-1；碰撞气：氩气；氩气气体流量：0.11 mL·min-1。5种农药的质谱参数如表2所示。

1.5 两种方法的比较

本研究采用胶体金快速检测卡和液相色谱-质谱联用仪分别对100份样品进行检测。其中，质控样品20批，实际样品80批。质控样品包含香蕉、芒果两种基质各10批次，每种基质包括空白样品4批次和基质加标样品6批次，加标样品含量分别为每种农药国家限值的1倍浓度水平和2倍浓度水平。实际样品为从市场上采集的香蕉、芒果各40批。

2 结果与分析

2.1 质控样品比对结果

如表3所示，针对1～4号、11～14号空白基质样品，仪器法均未检出农药，胶体金快速检测卡的检测结果均为阴性（-），两个方法的检测结果一致。而针对5～10号、15～20号加标质控样品，仪器法均检出相应加标浓度水平的农药，胶体金快速检测卡法除6号样品噻虫嗪项目、16号样品噻虫胺项目检测结果为阴性（-）外，其他样品5种农药均为阳性（+），与仪器法结果相符。结果表明，20批质控样品，5种农药残留中，除6号样品、16号样品出现假阴性外，其他样品检测结果无差异，准确率高达98%。胶体金快速检测卡法能够满足GB 2763—2021中有关香蕉农药最大残留限量的要求，适用于香蕉、芒果中5种农药残留的快速检测。

2.2 实际样品比对结果

由表4可知，胶体金快速检测卡共检出香蕉中吡虫啉3批次，分别为5号、9号、26号样品；芒果中噻虫胺4批次，分别为3号、5号、6号和30号样品，吡唑醚菌酯1批次，为19号样品；快检为阳性的样品，经LC-MS测定均检出相对应的农药，其中香蕉样品中吡虫啉含量分别为0.057、0.072、0.054 mg·kg-1，芒果样品中噻虫胺含量分别为0.090、0.062、0.067、0.076 mg·kg-1，吡唑醚菌酯含量为0.055 mg·kg-1，检出的农药含量均大于该农药国家限值（吡虫啉在香蕉中的限值为0.05 mg·kg-1；噻虫胺、吡唑醚菌酯在芒果中限值为0.04 mg·kg-1，0.05 mg·kg-1），两种方法的阳性样品检测结果相符合。其余样品为阴性样品，两种方法均未检出。经过比较，胶体金快速检测卡定性检测结果与仪器法定量检测结果的符合率为100%。结果表明，胶体金免疫层析法对快速检测热带水果中的吡唑醚菌酯、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪和苯醚甲环唑5种农药残留具有一定的可靠性。

3 结论