非转基因和转基因大豆中色氨酸含量分析

作者: 刘婷婷 李岩 徐则超 卓勤

非转基因和转基因大豆中色氨酸含量分析0

摘 要:目的:对大豆中色氨酸分析的碱水解方法进行研究,比较非转基因和转基因大豆中色氨酸的含量。方法:样品用氢氧化锂溶液水解提取,样液经中和定容、过膜后,用超高效液相-荧光检测器测定,外标法定量。结果:应用氢氧化锂对大豆样品进行碱水解,方法的回收率为90%~93%,相对标准偏差小于5.0%。非转基因和转基因大豆样品的色氨酸分析,转基因大豆的色氨酸含量均不低于非转基因大豆,其中的色氨酸可以满足人体健康需要。结论:该方法准确快速、重现性好,适用于大豆中色氨酸含量分析的检测要求。

关键词:色氨酸;大豆;转基因;非转基因

大豆富含优质蛋白质,是豆类作物中营养价值较高的植物[1]。色氨酸作为人体必需的氨基酸之一,参与机体多项代谢和合成的网络通路,其来源主要靠食物提供,色氨酸在代谢过程中与碳水化合物、蛋白质、脂肪、维生素和微量元素等各种营养素之间有十分密切的关系,充足的色氨酸供给是人类健康所需 [2]。培育优良品质的大豆品种对我国食物营养和食品安全工作有着重要意义,转基因大豆自问世之日起,其安全评价便广受专家学者和广大群众关注[3]。世界卫生组织(WHO)、联合国粮农组织(FAO)、经济合作与发展组织(OECD)等多家国际权威相关组织先后对转基因产品的必要性和安全评价工作进行了大量的研究探讨,在多家机构和相关研究组织推动、科研团队的努力下,抗虫、抗病等转基因大豆的研究取得一定进展[4-6]。

氨基酸分析在大豆的营养品质评价方面起着重要作用,色氨酸不同于其他氨基酸,它是碱性环境下稳定存在的氨基酸,在经典的酸水解的前处理过程中会被破坏,故不能在酸水解法中被同时检测分析,准确、高效地检测大豆色氨酸含量是大豆品质分析的重要研究方向。色氨酸具有紫外吸收和荧光发射特性,故不需要衍生可通过紫外检测器或荧光检测器直接进行检测。在参考国内外学者研究的基础上[7-9],超高效液相-荧光检测器法具有准确可靠、重现性好等特点,我们采用该方法对大豆中色氨酸含量检测进行研究。本试验对其色氨酸前处理过程进行优化,通过比较选用配有荧光检测器的超高效液相色谱仪进行分析,建立了准确快速的大豆中色氨酸含量检测方法,并对来自三亚、石家庄、北京3个不同试验基地的非转基因和转基因大豆样品进行测定,比较其所含的色氨酸含量,为评价转基因和非转基因大豆中的色氨酸含量提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

样品:大豆样品编号1~6,粉碎备用(用四分法缩减)。其中1、2、3号(中黄10-A,B,C)为非转基因大豆,4、5、6号(ZH10-6-A,B,C)为转基因大豆,A、B、C代表北京、石家庄、三亚3个不同的种植基地。 ZH10-6的大豆是中黄10的大豆品种通过转入耐除草剂G2-epsps、gat价基因获得。G2-epsps基因可以编码不被草甘膦抑制的EPSP酶,植物本身的EPSP酶对草甘膦非常敏感,在草甘膦处理下,植物由于不能合成芳香族氨基酸致死,通过编码修饰,在草甘膦存在的环境中,转入基因表达后能在植物体内执行植物免受草甘膦的破害的功能。另一个gat基因表达后可以在大豆植物体内降解草甘膦农药。

色氨酸标样,中国食品药品检定研究院;氢氧化锂和氢氧化钾(优级纯)、乙酸钠(色谱级),阿拉丁试剂公司;甲醇和乙酸(色谱级),MERK公司;配制试剂所用水为MilliQ纯水器处理的超纯水。

1.2 仪器和设备

ACQUITY I-CLASS超高效液相色谱仪,美国Waters;电热恒温干燥箱,上海森信。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液 称取2.0 mg的色氨酸标准品于10 mL容量瓶中,滴加0.1 moL/L的氢氧化钾溶液使其溶解,用水定容,得到浓度为200 μg/mL的标准储备液。准确吸取一定体积的标准储备液至10 mL容量瓶中,用水定容至刻度,得到浓度分别为5、10、25、50、75、100 μg/mL的标准溶液。

1.3.2 大豆样品预处理 称取粉碎后的均匀样品约0.10 g于聚四氟乙烯水解管中,管内加入4 mol/L氢氧化锂溶液1.5 mL,轻轻摇动混匀,然后充入高纯氮气,将四氟乙烯水解管放在110℃的恒温干燥箱中,水解20 h,取出后冷却至室温。将水解管内的水解液转移到25 mL容量瓶内,用乙酸钠(0.008 5 mol/L,pH=4)多次冲洗水解管并定容至25 mL,经0.22 μm滤膜过滤后供仪器测定。

1.3.3 色谱条件 色谱柱ACQUITY BEH C18,50 mm×2.1 mm,1.7 μm;发射波长283 nm,激发波长343 nm;色谱柱温度30 ℃;进样体积2 μL;流动相:乙酸钠(0.008 5 mol/L,pH=4):甲醇=90 ∶10;流速0.2 mL/min。

2 结果与分析

色氨酸作为人体所需要的必需氨基酸,高效液相色谱法被大多数研究者认为是一种可靠高效测定色氨酸的方法。GB/T 15400—2018《饲料中色氨酸的测定》将高效液相色谱法作为饲料中色氨酸的检测分析方法[10]。在此基础上,本研究采用配有荧光检测器的超高效液相色谱仪对转基因大豆和非转基因大豆中的色氨酸含量进行了测定,方法优化结果如下。

2.1 仪器条件优化

2.1.1 色谱条件选择 应用超高效液相色谱仪,比较了二极管阵列检测器和荧光检测器的分析效果。二极管阵列检测器的最佳波长为280 nm。荧光检测器的发射波长为283 nm,激发波长为343 nm。 吸取10 μg/mL标准溶液2 μL,分别应用二极管阵列检测器和荧光检测器分析。从图1、图2可以看出,基线平稳,目标峰均窄而尖,分离效果较好,二极管阵列检测器分析10 μg/mL标准溶液的信噪比为1 386,荧光检测器分析10 μg/mL标准溶液的信噪比为16 120。荧光检测器的响应强度明显优于二极管阵列检测器,因此本试验选择荧光检测器对大豆中的色氨酸进行分析。在样品分析中,色氨酸目标峰与样品中的其他杂质峰无干扰,该方法准确可靠。

2.1.2 方法的精密度 取同一产地、同一批次大豆样品6份,按上述前处理条件做精密度试验,测定的相对标准偏差小于5.0%,表明本检测方法重复性较好。

2.1.3 方法的检出限与定量限 在上述分析条件下,5~100 μg/mL标准曲线范围内,方程Y=7.27e+006 X+6.21e+006,R=0.999 8。结合大豆样本称样量和定容的体积,以3倍信噪比计算本方法检出限(LOD) 0.001 2 g/100 g,10倍信噪比计算方法定量限(LOQ)0.003 8 g/100 g。

2.2 水解方法对氨基酸检测结果的影响

2.2.1 碱水解液的确定 本试验前处理过程中比较了3种不同的碱水解试剂,分别是含1个结晶水的氢氧化锂溶液(4 mol/L)、不含结晶水的氢氧化锂溶液(4 mol/L)、不含结晶水的氢氧化钠溶液(5 mol/L),分别将其作为提取液对样品进行添加回收试验。应用含1个结晶水的氢氧化锂溶液的样本回收率为80%~82%。应用不含结晶水的氢氧化锂溶液的水解效果较好,样本添加回收率为90%~93%。应用不含结晶水的氢氧化钠溶液回收率相对较低,为61%~64%。本试验还比较了不同纯度的氢氧化锂对水解效果的影响,试验发现,纯度越高水解效果越好(表1)。通过比较,本试验使用了99.9%纯度的不含结晶水的氢氧化锂配置4 mol/L的溶解作为碱提取液。

2.2.2 水解时间的确定 水解18、20、22、24 h对大豆样本水解效果的影响如图3所示,随着水解时间的增加,水解效果逐渐提高,水解20 h和22 h的测定结果没有明显差异,优于24 h,考虑110℃高温水解时间过长会造成色氨酸的损失,为了节省时间及降低水解过程中的目标物降解,最终确定水解时间为20 h。

2.2.3 水解管材质的确定 因强碱溶液不能放置在玻璃容器中,本试验比较了聚四氟乙烯和聚丙烯材质的2种水解管的水解效果,试验发现聚四氟乙烯的密封性、耐腐蚀性优于聚丙烯水解管,所以本试验选用聚四氟乙烯材质的水解管。

2.3 样品检测结果

通过超高效液相色谱仪对3个试验基地的非转基因大豆和转基因大豆样品中的色氨酸进行分析及比较,2组样本的均值比较采用t检验,检验水准α=0.05,统计分析使用IBM SPSS 26.0软件(表2)。转基因和非转基因大豆中色氨酸差异无统计学意义(P>0.05)。转基因大豆中色氨酸含量不低于非转基因大豆中的含量,不同产地培植出来大豆的色氨酸含量不存在显著性差异。

3 结论

本试验通过对大豆色氨酸分析的碱水解方法和液相仪器条件进行研究,应用高纯度氢氧化锂作为碱水解液进行20 h水解,中和定容、过滤后使用配有荧光检测器的超高效液相色谱仪进行分析检测,分析步骤相对简单,重现性良好,回收率较高。通过对转基因农作物试验基地的非转基因和转基因大豆样品中的色氨酸进行检测,对试验所得数据进行分析,转基因和非转基因大豆中的色氨酸含量稳定,且色氨酸含量不存在显著性差异,其中的色氨酸可以满足人体健康需要。

参考文献

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[10]国家市场监督管理总局,中国国家标准化管理委员会.饲料中色氨酸的测定:GB/T 15400—2018[S].北京:中国标准出版社,2018.

Tryptophan Content Analysis of Non-transgenic and Transgenic Soybeans

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