笃斯越橘对心肌细胞氧化损伤的保护及UPLC-MS分析

摘 要：目的：探讨笃斯越橘对氧化损伤心肌细胞的作用。方法：以笃斯越橘果实为原料提取得到粗提物1个，并进一步纯化得到4个柱层析组分，建立H2O2氧化模型，考察提取物及纯化产物对氧化损伤细胞存活率的影响，并对最优组分进行成分分析。结果：笃斯越橘粗提物及4种纯化产物均能提高氧化损伤H9c2心肌细胞的存活率，其中30%乙醇水溶液洗脱组分效果最好，能有效减少ROS和MDA生成，提高SOD活性；对该组分进行超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS）分析，鉴定出花色苷14种。结论：笃斯越橘果实提取及纯化产物均对H2O2引起的H9c2心肌细胞氧化损伤具有保护作用。

关键词：心肌细胞；氧化损伤；笃斯越橘；超高效液相色谱-质谱联用分析；花色苷

氧化应激是缺血性心脏病、心力衰竭、高血压等诸多病理性心血管损伤的共通机制，在这些疾病发生过程中都有过量的活性氧（ROS）产生，大量积累时会引起细胞的氧化应激损伤，致使心肌细胞凋亡或坏死，而大量心肌细胞的凋亡和坏死进一步加重了疾病的程度［1-4］。减少细胞的氧化应激损伤，降低细胞凋亡对治疗心血管疾病具有重要的意义，采用心肌细胞作为实验氧化应激对象的研究越来越多［5-6］。作为重要ROS之一，过氧化氢（H2O2）易获得，性质比较稳定，极容易穿透细胞膜，在细胞内与铁离子经反应形成具有极高活性的自由基，因而渐渐成为细胞氧化损伤研究的重要工具［7-9］。

笃斯越橘（Vaccinium uliginosum ）为杜鹃花科越橘属落叶灌木［10］，为我国分布最广且储量最大的野生蓝莓。笃斯越橘果实形状多变，成熟时果皮蓝紫色，有白霜，果肉莹白多汁，口感细腻，风味酸甜、薄涩，有着悠久的食用历史及药用价值［11］。笃斯越橘果实中的花色苷和黄酮等活性成分的含量高于部分常见蓝莓品种，抗氧化能力较强［12-13］。近年来，笃斯越橘因其丰富的活性成分及显著的功效而受到相关各领域的关注和研究。本试验研究了笃斯越橘果实提取物对H2O2诱导H9c2心肌细胞氧化损伤的保护作用，并对其中主要的花色苷成分进行LC-MS分析，以期为我国野生蓝莓抗心血管氧化损伤的深入研究及开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

笃斯越橘，收集于大兴安岭地区塔河县；XDA-6树脂，南开大学树脂厂；H9c2心肌细胞，江苏凯基生物技术股份有限公司；DMEM培养基，Gibco公司；CCK-8试剂盒，碧云天生物技术有限公司；H2O2、抗坏血酸（维生素C）、活性氧检测试剂盒，Sigma公司；胎牛血清，Gibco公司；胰蛋白酶，北京索莱宝；MDA检测试剂盒、SOD检测试剂盒，南京建成生物工程公司。

1.2 仪器与设备

ACQUITY超高效液相色谱（配备2996 PDA检测器和Quattro Premier质谱系统），Waters公司；Bio-Rad680 酶标仪，美国Molecular Devices；CO2培养箱，美国Thermo Scientific；CK40倒置显微镜（型号IX51），Olympus公司；cytation 5高内涵细胞成像分析系统，美国BioTek公司；无菌操作台，上海BOXUN；BS210S电子天平，北京Sartorious有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取方法 采用超声波辅助提取工艺提取，提取液为体积分数70%的乙醇，料液比为1∶10（W1∶V）、提取温度设定40 ℃、提取时间30 min，提取2次，合并提取液。提取液48 ℃减压浓缩后冻干得到笃斯越橘花色苷粗提物，标记为D0。

1.3.2 纯化方法 采用柱层析法对笃斯越橘提取物进行分离纯化，通过固定相介质筛选和流动相介质优化，确定了分离的固定相介质为XDA-6型介质，依次以蒸馏水、10%乙醇水溶液、30%乙醇水溶液、50%乙醇水溶液、70%乙醇水溶液为流动相进行梯度洗脱，收集不同浓度乙醇洗脱液，得到4个分离纯化组分，分别标记为D1（笃斯越橘10%乙醇洗脱物）、D2（笃斯越橘30%乙醇洗脱物）、D3（笃斯越橘50%乙醇洗脱物）、D4（笃斯越橘70%乙醇洗脱物）。

1.3.3 H2O2损伤模型建立 试验时选择生长状态良好的H9c2心肌细胞，计数，调整细胞密度约5×103 个/mL，接种于96孔板内，0.1 mL/孔，CO2培养箱设定为37 ℃、CO2浓度5%，培养24 h。H2O2用DMEM培养基（无血清）稀释配制成50、100、200、400、800 μmol/L浓度梯度处理液，分别处理H9c2细胞1、2、3、4、5、6 h，每组6个重复。处理结束按照CCK-8试剂盒说明书操作检测细胞存活率。

1.3.4 笃斯越橘提取物最佳浓度选择 实验时选择生长状态良好的H9c2心肌细胞接种于96孔板内，培养24 h，每孔给予不同浓度的笃斯越橘提取物（0、0.1、1.0、10、50、100、200、300、400、500、1 000 mg/L）预处理1 h后，加入H2O2（400 μmol/L）处理2 h，加入CCK-8测试液，酶标仪于450 nm测定OD值，计算细胞相对存活率，每组6个重复。

1.3.5 笃斯越橘提取物处理时间选取 选择生长状态良好的H9c2心肌细胞接种于96孔板内，培养24 h，笃斯越橘提取物培养不同时间（0、1、2、4、12、24 h）后加入H2O2（400 μmol/L）处理2 h，加入CCK-8测试液，450 nm测定OD值，计算细胞相对存活率，每组6个重复。

1.3.6 不同笃斯越橘提取物纯化组分对心肌细胞的保护作用 选择生长状态良好的H9c2心肌细胞接种于96孔板内，培养24 h，分别加入5种不同笃斯越橘提取物纯化组分（D0、D1、D2、D3、D4）和维生素C溶液，培养2 h后加入H2O2（400 μmol/L）处理2 h，加入CCK-8测试液，450 nm测定OD值，计算细胞相对存活率，每组6个重复。

1.3.7 H9c2心肌细胞内ROS水平检测 选取生长状态良好的H9c2心肌细胞接种于6孔培养板中，在培养箱中生长24 h。加入相同浓度（100 mg/L）不同溶液处理，分别标记为DH（笃斯越橘提取物D2纯化物组）、VH（维生素C组）、CK（空白对照组）、Model（H2O2模型组）。培养心肌细胞2 h，加入H2O2浓度400 μmol/L，损伤处理2 h，用无血清DMEM稀释DFCH-DA浓度到10 μmol/L，干预结束后，在每孔加入1 mL，继续在培养箱培养30 min，再用无血清DMEM培养液洗3次，高内涵细胞成像系统分析，每组3个重复。

1.3.8 H9c2心肌细胞丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定 将细胞接种于6孔培养板中，在培养箱中生长24 h。各组处理方法同1.3.7，取处理后细胞按照MDA和SOD检测试剂盒说明书操作进行测定，每组3个重复。

1.3.9 UPLC-MS分析条件 ACQUITY超高效液相色谱，Aeris PEPTTDE XB-C18 色谱柱 （150 × 4.60 mm，3.6 μm，Torrance，CA）；流动相A为乙腈，流动相B为5%甲酸水溶液，梯度洗脱（0 min，5% A；2 min，7% A；10 min，7% A；20 min，15% A；30 min，80% A；35min，80% A；40 min，5% A）；检测波长为520 nm；流速1.0 mL/min；柱温为40 ℃；进样10 μＬ。正离子模式，扫描m／z 100和1 000之间的离子；毛细管电压0.6 kV；锥孔电压30 V；离子源温度120 ℃；脱溶剂气温度350 ℃。

1.3.10 统计学分析 采用统计软件 SPSS 17.0进行组间单因素方差分析，并进行t检验，以P＜0.05为差异显著用不同字母标记，利用R版本4.1.2加载数据包ggplot2进行绘图。

2 结果与分析

2.1 H2O2浓度和处理时间对心肌细胞存活率的影响

通过外源H2O2引起细胞内产生活性氧，造成氧化应激损伤模型。试验结果显示，不同浓度H2O2对H9c2心肌细胞的相对存活率影响不同。随着H2O2浓度升高，细胞相对存活率降低；400 μmol/L和800 μmol/L浓度下细胞相对存活率随时间延长而降低。在H2O2 浓度为400 μmol/L时处理2～3 h，心肌细胞存活率达到了（49.98±2.33）%，接近50%，表明400 μmol/L的H2O2能诱导适当氧化应激损伤及细胞活力，模型稳定、易重复，作为试验中的损伤模型使用（图1）。

2.2 笃斯越橘提取物浓度和培养时间对心肌细胞存活率的影响

图2为不同浓度笃斯越橘提取物对400 μmol/L H2O2氧化损伤处理心肌细胞存活率的影响。0.1、1、10 mg/L这3个浓度与单纯加入H2O2组细胞存活率（50.15%）无显著差异，而50～500 mg/L笃斯越橘提取物处理过的心肌细胞能显著改善H2O2对细胞存活率造成的影响，存活率最高提高至67.89%。浓度为1 000 mg/L时，心肌细胞的存活率也与H2O2组达到显著性差异，降低至40.54%，表明高浓度笃斯越橘提取物不利于心肌细胞生存。提取物预处理浓度范围100～300 mg/L效果最好，均可极显著降低H2O2诱导的H9c2心肌细胞损伤，各组间差异不显著，进一步分组试验中取100 mg/L作为提取物试验浓度。

如图3所示，加入笃斯越橘提取物培养0～24 h均对心肌细胞氧化损伤有较好的保护作用。各时间分组均与H2O2模型组差异显著，效果最好为培养时间2 h组，细胞存活率63.79%，与H2O2组相比死亡抑制率达到35.41%，为笃斯越橘提取物培养心肌细胞最佳试验时间。

2.3 笃斯越橘花色苷对心肌细胞保护作用

如图4所示，笃斯越橘各组分及维生素C均有保护心肌细胞的作用，细胞存活率与H2O2模型组比均达到差异显著。笃斯越橘中的D2组分表现最好，细胞存活率为70.17%，与H2O2组相比死亡抑制率达到37.62%。其次为D3组，细胞存活率为65.16%，与H2O2组相比死亡抑制率为27.79%。笃斯越橘粗提物D0组的保护作用最低，与H2O2组相比死亡抑制率仅为6.63%。

常用氧化应激化学诱导剂H2O2能引起细胞明显的氧化损伤。在本研究中，H2O2浓度为400 μmol/L时处理H9c2心肌细胞2 h，细胞相对存活率在50%左右，表明该氧化应激细胞损伤模型成功，结果与Chen等［14-15］的研究结果相一致。近年来研究发现，花色苷对细胞氧化损伤具有较好的保护作用，李亚巍等［16］发现，蓝莓花色苷对H2O2所致血管内皮细胞损伤具有明显的保护作用；刘迪等［17］研究表明，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对人胚肾HEK-293细胞氧化损伤具有保护作用，细胞活性显著提高，与本试验结果一致。本试验结果显示，富含花色苷的笃斯越橘提取物处于低浓度（0.1～10 mg/L）时对H9c2细胞活性无明显影响，而50～500 mg/L笃斯越橘提取物对H2O2诱导的H9c2心肌细胞活性的降低均有显著的改善作用。

2.4 笃斯越橘提取物处理可减少H2O2诱导的H9c2心肌细胞ROS生成

通过DCFH-DA探针检测确定经由笃斯越橘提取物D2预处理对H9c2心肌细胞氧化应激ROS水平的影响，如图5所示，显微镜下呈现绿色荧光为ROS，与CK组相比，H2O2模型组心肌细胞中释放ROS显著增多（P<0.01），DH、VH组则较H2O2组的ROS释放显著降低。H2O2组心肌细胞中荧光强度（417.6±30.7）比CK组增强了456.9%，而DH、VH组的荧光强度则下降为（139.3±16.2）、（142.7±22.1），比H2O2组分别降低了66.64%、65.84%。活性氧是机体正常的代谢产物，生物体内氧化过程中总是伴随着ROS的释放。其存在具有两面性：低含量的ROS对机体具有一定的积极生理作用，杀菌、解毒、细胞内信号转导、基因活性诱导、刺激生长、分裂和细胞凋亡等；大量的ROS则会对机体造成损伤［18］。DCF荧光探针法是通过DCFH-DA进入细胞膜后水解，被细胞内的ROS氧化生成有荧光的DCF。绿色荧光强度与ROS的水平成正比，根据荧光信号强度可分析ROS的水平。结果表明，笃斯越桔提取物D2和维生素C均能有效清除心肌细胞内的活性氧，降低H2O2带来的氧化损伤。