石斛生物碱类成分药理活性及其作用机制研究进展

摘要：目的：总结石斛生物碱类成分如石斛总生物碱、石斛碱、石斛宁等药理活性及其作用机制的研究现状，为石斛的合理开发和临床应用提供科学依据。方法：检索近10年中国知网CNKI数据库及PubMed数据库中石斛生物碱类成分药理活性相关文献，根据活性及机制的不同进行总结归纳。结果：目前石斛生物碱类成分的药理活性研究主要集中于神经保护、改善糖脂代谢、保护肝损伤以及抗肿瘤等方面，具有较好的研究前景和开发应用价值。但作用机制的研究对象多为石斛总生物碱，有关生物碱类单体化合物的研究因受到分离纯化困难和提取率低等因素的制约而相对较少。结论：通过提高石斛生物碱类单体化合物提取率和纯度，加强对石斛药效物质基础及机制途径的研究，可为开发石斛相关新药及保健食品提供科学依据。

关键词：生物碱；石斛碱；药理活性；神经保护；改善记忆；糖脂代谢石斛是兰科石斛属植物的总称，主要生长于秦岭-淮河以南，集中分布在云南、广西、贵州、海南等省区。经统计，目前我国共有石斛属植物104种，其中13种为我国所特有[1]。石斛药用历史悠久，在秦汉时期的《神农本草经》中首次提及，《本草思辨录》《本草经集注》《名医别录》等古籍也均有记载，被称为“九大仙草”之首。《中国药典》中对石斛的记载为性甘，味微寒，归胃、肾经，能益胃生津、滋阴清热[2]。多项研究表明，石斛主要活性成分包含多糖类、生物碱类、联苄类、菲类、酚类等。其中，石斛生物碱类成分具有神经保护、抗肿瘤、降血糖、降血脂、保护肝损伤等药理作用，具有极高的科研价值和经济价值，开发利用前景广阔[3-5]。本文对石斛生物碱类成分的概况及药理作用的研究进展进行综述，为石斛生物碱类成分的进一步开发应用提供科学依据。

1石斛生物碱类成分概况

目前已报道的石斛生物碱类成分共52个，按结构式分类可分为倍半萜、八氢中氮茚、四氢吡咯、咪唑和酰胺5类[6-7]，其中金钗石斛含有生物碱种类最多、含量最高[8]，金钗石斛总生物碱（DNLA）中的主要成分是石斛碱，占总生物碱含量92%以上[9]。除了石斛植物种类的不同会引起生物碱类成分含量的差异外，植株部位、栽培条件、采收期、生长地区和加工方式等也会影响石斛生物碱类成分的含量[10]。目前，常用的石斛生物碱类成分提取方法主要有醇提法、有机溶剂提取法和酶提取法。有机溶剂提取生物碱纯度较高，但此类溶剂毒性较大；醇提法具有成本低、毒性较低等优点，缺点为提取液中含有脂溶性杂质需要进一步的纯化去除杂质[11-12]。酶提取法在保证生物碱类活性成分完整率和高提取率的同时，其纯度和活性均优于传统的提取方法[13-14]，值得进一步研究。通过酶提取方法与有机溶剂或醇溶剂提取法相结合，优化提取方式，提高石斛生物碱类成分的提取率。

另一方面，可通过提高石斛植株中生物碱的含量增加生物碱得率，如今已筛选出11个与石斛碱合成途径相关的关键酶基因：甲羟戊酸激酶基因（Unigene1219）、赖氨酸甲基化酶基因（CL429）、异戊烯焦磷酸异构酶基因（CL3435）、法尼基转移酶基因（CL11407）、半胱氨酸甲基酯酶基因（CL8067）、乙酰辅酶A酰基转移酶基因、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶（MVD）基因、磷酸甲羟戊酸激酶基因、萜烯合酶（TPS21）基因、托品酮还原酶基因Dn TRI、Dn TRII[10]，通过对这些关键酶基因表达调控、转基因等手段实现生物碱在石斛中的高效合成，使石斛生物碱类活性成分提取更高质高效。如李清等[15]研究发现，MVD基因的表达受到菌根真菌（Mycena sp.）的影响，其表达量在接菌后期显著高于未接菌组，Mycena sp.可能是通过抑制MVD基因表达量的降低而提高石斛碱含量。目前，对关键酶基因的研究还停留于真菌通过基因调控对石斛碱含量的影响，关于植株自身基因调控机制的影响暂时没有报道[16-25]。

2石斛生物碱类成分药理作用

石斛生物碱类成分主要的药理活性作用有神经保护、改善糖脂代谢、抗肿瘤、保护肝损伤等。目前报道有活性作用的生物碱类成分主要是来自金钗石斛、霍山石斛、美花石斛、玫瑰石斛，其中有活性的生物碱粗提物主要为从金钗石斛提取的DNLA、水溶性生物碱、脂溶性生物碱，以及从霍山石斛提取的石斛碱；生物碱单体包括从金钗石斛提取的石斛碱、美花石斛提取的石斛宁、玫瑰石斛提取的Dendroclepine。

2.1神经保护

石斛生物碱类成分可以透过血脑屏障进入脑组织且分布范围明确，为其具有神经药理作用提供了科学依据[26]。研究表明，石斛生物碱类成分具有较好的改善记忆、保护神经元损伤、预防帕金森以及抗氧化应激等神经药理作用。

2.1.1改善记忆认知功能障碍广泛存在于老年人群中，主要包括与年龄相关的记忆下降以及阿尔茨海默症（AD）所伴随的记忆力损害[27]。陈建伟等[28]首次研究发现，DNLA能通过抑制神经元凋亡以及减少神经元中β-淀粉样蛋白1-42（Aβ_1-42）的含量，进而改善脂多糖（LPS）诱导的大鼠学习记忆功能减退。利用实时荧光定量PCR（q-PCR）技术对凋亡相关基因表达进行检测，发现DNLA不仅能下调半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）3/8 mRNA的表达，还能直接减少β淀粉样前体蛋白（APP）的异常高表达和裂解，最终降低脑内Aβ1-42和 APP的产生。张成宸等[29]研究发现，DNLA能有效抑制Aβ_1-42诱导的PC12细胞凋亡，其作用机制主要与负向调控钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶（CaMKK2）的Ser511位点磷酸化，下调Caspase-3蛋白表达和活化有关。α-、β-、γ-分泌酶是APP水解形成的Aβ蛋白多肽的3类关键酶。通过蛋白免疫印迹（Western Blot）分析关键酶的蛋白水平，发现DNLA能通过增加α-分泌酶含量，降低β-、γ-分泌酶从而抑制Aβ的生成。如姚寅等［30］研究发现，DNLA长期给药可以改善AD转基因模型Tg2576小鼠的空间学习和记忆功能，降低小鼠脑内β-和γ-分泌酶的含量，进而减少大脑内Aβ的沉积。张明辉等[31]研究表明，DNLA能抑制β位淀粉样前体蛋白裂解酶（BACE1）蛋白表达，减少大鼠海马组织Aβ_1-42的含量。Huang等[32]研究发现，DNLA能增加解整合素金属蛋白酶17（ADAM17）的蛋白表达，降低大鼠海马神经元Aβ_1-42的蛋白表达，表明DNLA能通过调节α-和β-分泌酶来降低Aβ的含量。

DNLA能通过促进海马神经元中自噬体的形成和降解，并能通过改善自溶体酸化和蛋白水解进而促进细胞内Aβ的降解，值得进一步研究探索。李利生[33]应用q-PCR和Western Blot方法探究了DNLA抗AD的作用机制，结果表明，DNLA能通过雷帕霉素靶蛋白（mTOR）/自噬相关基因ULK1信号通路诱导PC12细胞的自噬并拮抗Aβ_25-35诱导PC12的损伤；经DNLA处理之后的海马神经元，其自噬相关基因Beclin1和ATG5蛋白水平上调，反映自噬体数量的内源性指标微管相关蛋白1轻链3 II（LCII）/LCI蛋白水平比值显著增加[34-35]。Nie等[36]通过免疫荧光染色法和Western Blot方法研究发现，DNLA能通过上调v-ATP酶A1的蛋白质水平，改善自溶体酸化和蛋白水解，进而恢复正常溶酶体蛋白水解和自噬效率。DNLA可通过保护神经元和突触丧失来减轻小鼠的空间学习和记忆损伤。Nie等［37］研究表明，DNLA可通过增加脑源性神经营养因子（BDNF）、胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）和睫状神经因子（CNTF）的表达来预防神经元凋亡和突触丧失。姜琳珊等[38]研究发现，Morris水迷宫实验测试中DNLA组APP/PS1（早老素-1）转基因小鼠的空间学习记忆能力明显增强，DNLA组较模型组小鼠海马的神经元数量及尼氏小体增多。杨小惠［39］的研究同样证明了DNLA可改善APP/PS1小鼠学习记忆功能障碍。利用硫磺素-S和尼氏染色法分析发现，DNLA能减少老年斑的沉积及增加神经元数目，同时Western Blot结果显示，其机制可能与减少Aβ含量、抑制核转录因子（NF-κB）活化、上调突触素（SYP）和突触后密度蛋白-95（PSD-95）蛋白表达水平有关。另有DNLA或许是通过提高SYP和PSD95的蛋白表达水平，激活Wnt/β-连环蛋白（Wnt/β-catenin）信号通路来保护突触完整性，进而抑制Aβ_25-35诱导的神经毒性和突触损伤[40-41]。

近年来，在大量的神经退行性疾病中发现了类似神经原纤维缠结的病理改变，AD的特征性病理特征之一就是微管相关蛋白（tau）的高磷酸化。铁皮石斛生物碱提取物可抑制LPS诱导的大鼠海马中tau蛋白过度磷酸化，并防止大鼠脑凋亡[42]。Liu等[43]研究表明，DNLA可通过下调蛋白激酶RNA样内质网激酶（PERK）信号通路，进而改善小鼠学习和记忆障碍；Western Blot结果表明，DNLA可通过下调内质网应激相关蛋白钙蛋白酶1（CAPN1）、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）和细胞周期蛋白依赖性激酶-5（CDK5）水平，最终降低tau蛋白的过度磷酸化。

综上，DNLA改善学习记忆障碍的相关机制如附表。笔者认为，DNLA具有多靶点、多途径、副作用低等特点，其在开发AD治疗药物方面具有较好的发展前景，下一步可以利用转基因AD动物模型进行行为学评估及作用机制靶点多样化的深入研究。

2.1.2改善脑缺血再灌注的神经损伤缺血/缺氧后再灌注/复氧会增加自由基产生量，自由基过多引起的炎症和氧化应激反应可导致神经细胞坏死和凋亡[44]。Wang等［45］研究发现，从Dendrobium spez.中提取的石斛碱粗提物能缓解钙超载并阻止基质金属蛋白酶（MMP）的减少，进而抑制氧-葡萄糖剥夺/复氧（OGD/R）诱导的神经元凋亡。为了在mRNA水平上阐明抗凋亡机制，利用q-PCR分析后发现石斛碱粗提物主要通过下降Caspase-3和Caspase-12的表达，进而抑制神经元的凋亡。Liu等[46-47]研究发现，DNLA极有可能是通过抑制细胞凋亡，进而发挥神经保护作用。其通过流式细胞术检测发现DNLA组细胞凋亡率较模型组明显降低，利用免疫荧光法检测Caspase-1荧光表达和Western Blot测定Caspase-1、消皮素D（GSDMD）和炎症因子白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-6、IL-18蛋白水平后，结果发现，DNLA可降低焦亡相关蛋白Caspase-1、GSDMD及炎症因子蛋白水平表明，DNLA抗凋亡机制可能与Caspase-1/IL-1β、IL-6、IL-18和Caspase-1/GSDMD/IL-1β、IL-6、IL-18通路有关。刘晓莉等[48]利用网络药理学总结了石斛碱治疗脑缺血再灌注损伤的作用机制，认为石斛碱主要通过抑制炎症、凋亡途径发挥保护作用，关键靶点基因主要为以下10个：ALB、MAPK1、MAPK8、CASP3、IGF1、HSP90AA1、SRC、NOS3和MMP2、ESR1，下一步可从这些关键靶点着手，如通过体内外造模，运用免疫荧光染色法及流式细胞术等分析方法对石斛生物碱类成分治疗脑缺血再灌注损伤的作用机制进行进一步的探索。

2.1.3预防帕金森帕金森病（PD）特征是进行性地丧失黑质多巴胺（DA）神经元。苏双巧［49］用石斛碱干预神经毒素1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP+）诱导小鼠神经元损伤后，比色法检测发现，石斛碱能显著降低MPP+诱导的乳酸脱氢酶（LDH）含量，减轻神经元损伤。另一方面，q-PCR和Western Blot结果显示，石斛碱可通过增高中脑星形胶质细胞源性神经营养因子MANF mRNA和蛋白表达水平，抑制神经元凋亡。Li等[50]通过酶联免疫吸附法和比色法测定肿瘤坏死因子（TNF-α）、IL-1β水平和6-羟基多巴胺（6-OHDA）产生的一氧化氮（NO），发现DNLA给药后能显著减弱促炎因子TNF-α和IL-1β的释放，降低NO的产生，并增加DA神经元的数量，进而改善6-OHDA诱导的神经炎症。帕金森发病机制研究证实与遗传易感性、炎症、破坏神经元、线粒体功能障碍和氧化应激等机制有关[51]。而研究发现，石斛生物碱类成分的预防帕金森机制为保护神经元、抑制炎症产生，可以考虑探索石斛生物碱类成分对线粒体功能障碍、氧化应激等帕金森发病机制的保护作用。