芹菜素对二肽基肽酶IV的抑制作用及其机制

摘要：目的：探究芹菜素降血糖作用的机制。方法：考察不同浓度的芹菜素对糖尿病治疗靶点二肽基肽酶IV（dipeptidyl peptidase-4，DPP-4）的抑制活性，并进一步利用酶动力学、荧光光谱、分子对接等实验手段明确了芹菜素对DPP-4的抑制类型以及作用机制。结果：芹菜素对DPP-4具有可逆的非竞争性抑制作用，其半数抑制浓度为（62.45±1.22）μg/mL；芹菜素主要通过氢键和范德华力作用与DPP-4形成基态复合物，造成DPP-4内在荧光的猝灭；芹菜素可与DPP-4分子中VAL-207、ARG-358、TYR-662残基形成较强的氢键，并与周围众多的疏水残基存在疏水作用，共同维持该复合物的结构。结论：本试验结果可为芹菜及芹菜素类降血糖产品的开发提供科学依据。

关键词：芹菜素；二肽基肽酶IV；抑制；互作；分子对接二肽基肽酶IV（DPP-4）是哺乳动物的一种重要丝氨酸水解酶，可分解胰高血糖素样肽-1（GLP-1）和葡萄糖依赖性促胰岛素肽（GIP）等肠促胰岛素，从而阻断其对胰岛素分泌的促进作用，因此被认为是治疗2型糖尿病的重要靶点[1-2]。芹菜素是人类日常饮食中重要的类黄酮之一，广泛存在于多种水果、蔬菜以及茶叶中，其中尤以芹菜中含量较高，是芹菜中最主要的生物活性成分之一[3-6]。研究表明，芹菜素具有明显的降血糖作用[7]。刘俊法[8]对糖尿病大鼠连续4 w进行芹菜素腹腔注射给药治疗，发现可显著降低糖尿病大鼠血糖水平。Mao等[9]研究表明，糖尿病大鼠在连续给药3 w后，40 mg/kg芹菜素治疗组血糖可较对照组降低50%以上。芹菜素可减轻高脂饮食诱导肥胖小鼠的胰岛素抵抗（IR）[10-11]、改善葡萄糖耐量减低（IGT）[11-12]、保护胰岛β细胞免受氧化损伤[13-14]、抑制α-葡萄糖苷酶活性[15-16]，从而起到调节血糖作用。Kalivarathan 等[17-18]对高脂高糖饮食大鼠进行芹菜素腹腔注射给药处理，发现芹菜素处理组大鼠血浆及海马组织中DPP-4的活性均显著低于对照组，而血浆GLP-1水平显著提高，提示DPP-4活性可能得到抑制。本研究通过体外试验方法结合分子模拟，明确芹菜素对DPP-4的抑制作用及其分子机制，以进一步阐释芹菜素降血糖作用的机制。

1材料与方法

1.1材料与试剂

芹菜素（纯度≥98%）;Tris-HCl（pH 8.0，1.0 mol/L），北京索莱宝科技有限公司；二肽基肽酶IV（人，EC 3.4.14.5）、Gly-Pro-7-amido-4-甲基香豆素氢溴酸盐（Gly-Pro-AMC）、二甲基亚砜（DMSO），美国Sigma-Aldrich公司；其他试剂均为分析纯。

1.2仪器与设备

SpectraMax i3X酶标仪，美国Molecular Devices；F7000荧光分光光度计，日本Hitachi。

1.3方法

1.3.1芹菜素对DPP-4的抑制能力芹菜素对DPP-4的抑制评价方法参考Proenca等[19]的方法，并稍加修改。先用50 mmol/L的缓冲液配置浓度为1.73 mU/mL的DPP-4溶液和浓度为200 mmol/L的底物Gly-Pro-AMC溶液。准确移取24 μL的DPP-4溶液，分别加入26 μL的待测样品溶液，在37℃反应15 min后，再加入50 μL的Gly-Pro-AMC溶液。放置37℃下反应15 min后，酶标仪在λex=360 nm、λem=460 nm下进行荧光测定。空白组为不加样品溶液，样品空白组为不加酶，每次试验3次重复。芹菜素对DPP-4抑制率按式（1）计算。

1.3.2芹菜素对DPP-4的抑制类型判断根据酶促反应动力学判断抑制类型，具体方法参照Morikawa等[20]的方法。选择不同浓度的芹菜素（0、50、100 μg/mL），首先固定Gly-Pro-AMC（最终浓度100 μmol/L），通过改变酶的浓度（0.21、0.42、0.63、0.84 mU/mL），以酶反应速率为纵坐标，酶浓度为横坐标判断反应是否可逆。然后再固定酶浓度，设定底物Gly-Pro-AMC浓度（50、100、150、200 μmol/L）绘制Lineweaver-Burk双倒数曲线，从而确定抑制类型，计算公式为式（2）：

1.3.3荧光光谱测定在298K和310K温度下，分别测定DPP-4的发射光谱，随后加入不同浓度的芹菜素，保持终浓度为0～28 μg/mL，浓度间隔为4 μg/mL，混合并静置3 min后进行样品测量。激发波长为280 nm，发射波长范围为290～400 nm，狭缝宽度为5 nm，扫描速度为1 200 nm/min。利用Stern-Vlomer方程判断芹菜素对DPP-4的猝灭机理[21]，公式如式（3）：

1.3.4分子对接通过Pubchem数据库下载Apigenin化合物（520-36-5）数据的sdf格式，通过Chem3D中的MM2模块对所下载的化合物进行几何优化以及能量最小化，并转化为pdb格式，将小分子化合物导入AutoDock Tools-1.5.6软件删除水分子并添加原子电荷、分配原子类型，将所有柔性键默认可旋转，最后保存为pdbqt文件。从PDB数据库下载二肽基肽酶IV的晶体结构PDB格式文件，采用Pymol 2.1软件删除蛋白分子中的无关小分子后，将蛋白分子导入AutoDock Tools-1.5.6软件删除水分子、添加氢原子以及设置原子类型，最后保存为pdbqt文件。将处理后的Apigenin化合物作为小分子配体，DPP4蛋白靶点作为受体，根据小分子与靶点的作用位点确定的Grid Box的中心位置（x=40.85，y=51.23，z=35.57）以及长宽高（50×50×50），最后通过AutoDock 进行分子对接，对结果进行分析，化合物与蛋白的结合模式可视化采用Pymol 2.1软件。

1.3.5数据处理数据分析使用SPSS统计软件，不同质量浓度测量3次，数据表示为平均值±标准差，统计显著性差异由P＜0.05判断。

2结果与分析

2.1芹菜素对DPP-4的抑制效果

如图1所示，随着质量浓度的增加，对DPP-4的抑制效果逐渐增强，呈浓度依赖性抑制，表现出了很好的DPP-4抑制能力，通过曲线拟合计算可以确定出其半数抑制浓度（IC₅₀）值为（62.45±1.22）μg/mL。

2.2芹菜素对DPP-4的抑制类型

由图2（A）可知，不同质量浓度下的直线都过原点，并且随之浓度的增加，斜率逐渐降低，说明芹菜素能可逆性地抑制DPP-4的活性[23]。进一步采用Lineweaver-Burk双倒数图法确定出芹菜素对DPP-4的抑制类型。由图2（B）可知，不同浓度下芹菜素对DPP-4的抑制动力曲线交于X轴，根据式（2），表现为随着芹菜素浓度的增加，最大反应速率V_max依次减少，米氏常数K_m保持不变，因此芹菜素对DPP-4的抑制类型为典型的非竞争性抑制。

2.3芹菜素对DPP-4的荧光淬灭效应

荧光光谱是研究小分子和蛋白质作用的常见方法，可以确定其相互作用的方式、作用力等[24]。DPP-4中含有色氨酸和酪氨酸残基，在一定激发波长下，可以发生较强的荧光。由图3可以看出，当激发波长在280 nm时，DPP-4的最大发射波长为332 nm。随着芹菜素质量浓度的增加，DPP-4的荧光强度呈规律性下降，说明芹菜素与DPP-4酶之间存在相互作用。随着芹菜素浓度的增加，发射峰发生蓝移现象（332～328 nm），表明此时DPP-4发色基团周围的微环境发生了变化，芹菜素与DPP-4之间存在着相互作用，向疏水的环境中转变[25]。

采用Stern-Volmer方程分析不同温度下的荧光数据，从图4（A）可以看出，芹菜素对DPP-4的Stern-Volmer曲线具有良好的线性，说明其猝灭过程为单一的动态或者静态。随着温度的升高，其K_sv值降低，并且K_q远大于生物大分子最大散射碰撞猝灭常数2×10¹⁰L/（mol·s）。结果表明，芹菜素对DPP-4的猝灭过程为静态猝灭。通过静态猝灭公式，得到芹菜素对DPP-4的双对数曲线图，如图4（B）。根据直线的斜率和截距计算出K_b和n值。由附表中芹菜素对应的K_b值都随之温度的升高而降低，说明抑制剂-酶复合物的稳定性随着温度的升高而降低。另外，不同温度下的n值接近于1，表明芹菜素与DPP-4只存在一个结合位点。

通过公式计算出焓变ΔH、熵变ΔS、吉布斯自由能ΔG的变化，进而判断出芹菜素对DPP-4的相互作用力。当ΔH＞0且ΔS＞0时，主要作用力为疏水作用力；当ΔH＜0且ΔS＞0时，作用力为静电相互作用；当ΔH＜0且ΔS＜0时，主要作用力为范德华力和氢键。由附表可见，吉布斯自由能ΔG均为负值，说明芹菜素与DPP-4的结合是自发进行的，且ΔH、ΔS均为负值，表明芹菜素与DPP-4的结合主要为氢键和范德华力[26]。

2.4分子对接

分子模拟对接是研究小分子和蛋白质作用的重要工具，可以确定二者的结合位点[27]。芹菜素与DPP4靶点蛋白的分子对接结果表明，芹菜素与DPP4存在很好的结合作用且匹配度高（结合能小于-5 kcal/mol）。将对接后芹菜素与DPP-4形成的复合物利用Pymol 2.1软件进行可视化，得到芹菜素与DPP-4的结合模式，根据结合模式可以很清晰地看到芹菜素与DPP-4口袋的相结合的氨基酸残基。如图5所示，芹菜素与DPP4结合位点存在相互作用的氨基酸有ARG-358、PHE-357、TYR-666、TYR-547、TYR-662、ASN-710、GLU-206、SER-209、VAL-207等。芹菜素属于黄酮类化合物，具有一定的疏水性，能够与PHE-357、TYR-666、TYR-547、TYR-662、VAL-207氨基酸形成很强的疏水相互作用，特别是PHE-357、TYR-547氨基酸的苯环部分与该化合物形成很强的π-π共轭相互作用，对锚定蛋白口袋中的小分子有着重要作用；另外，该化合物的酚羟基还能够与VAL-207、ARG-358、TYR-662氨基酸形成很强的氢键相互作用，氢键距离分别为1.9、3.5、1.9，这对稳定小分子也有着重要贡献。结合图5可以看到，该芹菜素分子一部分深入到DPP4口袋深处，另一部分也与DPP4的凹槽有很好的匹配。综上，芹菜素与DPP4的位点匹配较好，能够与DPP4蛋白形成稳定的复合物，与蛋白有着很好的关联性，是潜在的活性化合物。

3结论

本研究系统考察了芹菜素对DPP-4的抑制及互作情况，借助分子模拟对接，更加精准地揭示出芹菜素抑制DPP-4的分子机制。结果表明，芹菜素呈剂量依赖性抑制DPP-4的活性，并且具有明显可逆的非竞争性抑制作用。芹菜素可在氢键和范德华力作用力驱动下，与DPP-4形成复合物，使蛋白质发生荧光猝灭效应，结合位点数为1。分子对接结果进一步表明，芹菜素位于酶的疏水口袋中，与残基VAL-207、ARG-358、TYR-662形成较强的氢键，并与周围众多的疏水残基存在疏水作用，共同促进了小分子和蛋白口袋的结合。综上，芹菜素能够与DPP-4高效结合，是潜在的对DPP-4有较好抑制活性的化合物。本研究结果可为芹菜及芹菜素类降血糖产品的开发提供理论依据。参考文献

［1］Deacon C F. Physiology and pharmacology of DPP-4 in glucose homeostasis and the treatment of type 2 diabetes [J]. Frontiers in Endocrinology，2019（10）： 80.