基于网络药理学和分子对接技术探讨白果抗氧化作用机制

摘要：目的：基于网络药理学及分子对接技术初步探讨白果抗氧化的作用机制。方法：通过TCMSP数据库收集白果活性成分及靶点；利用GeneCards、OMIM和NCBI数据库对抗氧化靶点进行收集；利用STRING数据平台对药物和疾病靶标进行蛋白质-蛋白质相互作用分析（PPI），并将结果导入Cytoscape 3.9.1软件，拓扑分析得到核心靶点；基于核心靶点通过DAVID数据库进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，建立“活性成分-核心靶点-通路”网络图并进行拓扑分析，筛选得到核心成分和核心靶点。利用AutoDock Vina进行分子对接对核心成分和核心靶点的相互作用进行验证。结果：共获得白果活性成分15个，对应靶点142个，疾病靶点11 255个，共有靶点139个。经过蛋白互作及拓扑分析，得到核心靶点13个，核心靶点涉及139个基因功能条目和71条通路（P<0.05）。将“活性成分-核心靶点-通路”网络图进行拓扑分析，共筛选出表没食子儿茶素没食子酸酯、槲皮素、β-胡萝卜素、山柰酚、芒柄花素、异鼠李素、β-谷甾醇和（+）-儿茶素共8个核心成分，以及CASP3、CCND1、MYC、CTNNB1、MAPK8、FOS、EGFR、VEGFA、IL6、ESR1共10个核心靶点。结论：白果抗氧化具有多成分、多靶点和多通路的作用特点，白果活性成分可能通过上调VEGFA、ESR1蛋白的表达，下调CASP3、CCND1、MYC、CTNNB1、MAPK8、EGFR、IL6蛋白的表达，激活癌症、传染病、信号传导、内分泌代谢等相关通路来实现抗氧化作用。

关键词：白果；抗氧化；网络药理学；分子对接；作用机制白果为植物银杏的种核，药食同源，具有很高的营养和药用价值 [1-3]，具有抗氧化、抗炎、神经保护、抗肿瘤、抗菌、抗病毒等药理活性[4]。白果中药治疗疾病存在多成分、多靶点、多通路同时作用的特性[5]。白果抗氧化作用较为明确，但其具体的作用机制研究还不够清楚。网络药理学适用于中药复杂成分的解析和开发[6]，可对白果抗氧化的作用机制进行系统全面的分析。本研究运用网络药理学结合分子对接对白果活性成分、作用靶点、信号通路等进行系统分析，探究白果抗氧化的分子机制，为白果的进一步开发和利用提供科学依据。

1材料与方法

1.1数据库与软件

TCMSP数据、PubChem数据库、Uniprot数据库、人类基因组数据库（GeneCards）、人类孟德尔遗传数据库（OMIM）、美国国家生物技术信息中心（NCBI）基因数据库、功能关联蛋白网络数据库（STRING）、DAVID数据库、微生信、Perl软件、Cytoscape3.9.1软件、Chem 3D 20.0软件、AutoDock Vina软件、Pymol软件、AutoDockTools-1.5.7软件、Open Babel软件、Chem Draw 20.0软件、Origin 2021软件。

1.2白果活性成分筛选及靶点预测

利用中药系统药理学数据库和分析平台TCMSP检索白果的所有化学成分，根据口服生物利用度（OB＞30%）和类药性（DL＞0.18）为筛选条件，得到白果活性成分。利用TCMSP获取白果活性成分对应的靶点，并结合UniProt数据库对靶基因进行注释，合并后去除重复靶点，即为白果活性成分的靶点。

1.3白果抗氧化相关靶点的收集

在GeneCards、OMIM和NCBI数据库中，以“antioxidant activity”“antioxidation” “oxidation resistance” “anti-oxidant” “oxidative stress”为关键词搜索，获得抗氧化相关靶点。将所有收集的抗氧化相关靶点合并，除去重复后得到抗氧化相关靶点。利用Venny 2.1.0 在线分析工具，绘制白果活性成分相关靶点与抗氧化相关靶点的韦恩（Venny）图，通过取交集的方法获取白果活性成分抗氧化的共同靶点。

1.4蛋白质与蛋白质相互作用网络的构建

将白果活性成分抗氧化的靶点上传至STRING数据库，限定物种为 “Homo sapiens”，设置最低相互作用阈值中等置信度（>0.4），其余参数为默认，得到PPI数据，将数据导入Cytoscape 3.9.1，运用CytoNCA插件计算度中心性（DC），介度中心性（BC）和接近中心性（CC），先以DC大于2倍中位数进行筛选，再筛选出DC，BC及CC大于中位数的靶点，经过两次筛选得到的靶点为核心靶点，构建核心靶点的PPI网络。

1.5白果核心靶点的GO功能和KEGG通路富集分析

将核心靶点上传DAVID数据库，进行基因本体（GO）功能注释和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析，以P<0.05为筛选条件。获得生物过程（BP）、细胞成分（CC）、分子功能（MF）和KEGG关键信号通路的富集信息，并对结果进行可视化分析。

1.6白果抗氧化“活性成分-核心靶点-通路”网络图的构建涉及的活性成分与20条通路及其相关靶点导入Cytoscape 3.9.1软件，得到“活性成分-核心靶点-通路”网络图。利用插件CytoNCA计算网络中成分节点进行拓扑分析，反向筛选白果抗氧化的有效成分及关键基因。

1.7白果活性成分抗氧化核心成分与核心靶点的分子对接验证将“活性成分-核心靶点-通路”网络图反向筛选的有效成分与网络图中DC≥10的关键基因进行分子对接验证。将PubChem下载有效成分2D结构，利用Chem 3D 20.0软件进行能量最小化处理后导出3D结构。从PDB数据库下载关键基因的三维结构。利用Pymol软件对核心靶点进行去水、移除溶剂分子、去原配体等预处理，利用AutoDockTools-1.5.7对核心成分和核心靶点进行加氢、电荷计算等操作。运行AutoDock Vina进行分析对接，根据结合能用Origin软件绘制热图，分析结合能的大小，使用Pymol软件对对接结果进行可视化。

2结果与分析

2.1白果活性成分和作用靶点的筛选

在TCMSP中，以OB和DL值为筛选条件，共得化合物21个，将对应靶点利用UniProt数据库对靶点进行注释得到活性成分15个（附表），对应靶点142个。

2.2白果抗氧化相关靶点的收集

将GeneCards、OMIM和NCBI数据库收集到的靶点合并去除重复后，共获得11 255个抗氧化相关靶点。利用在线分析工具Venny 2.1.0将白果活性成分靶点与抗氧化靶点绘制韦恩图，得到共有靶点139个（图1）。

2.3PPI网络构建与分析

将得到的139个白果活性成分抗氧化的潜在靶点，上传至STRING，设置最低相互作用阈值置信度（>0.4），构建蛋白互作网络图，将数据导入Cytoscape 3.9.1软件，利用CytoNCA插件计算网络节点的DC、BC和CC值。先以DC大于2倍中位数38进行筛选，再筛选出DC、BC及CC大于中位数50.5、326.245 145及0.594 237 95的靶点，经过两次筛选得到13个靶点作为核心靶点，按照DC值排序为MYC、ALB、IL6、CTNNB1、ESR1、CASP3、CCND1、HIF1A、EGFR、PPARG、VEGFA、FOS、MAPK8。图2表明蛋白与蛋白的相互作用，线条越多表明关联度越大，作用也就越强。图3中靶点的节点越大颜色越深，代表degree值越大，表示与其相关的靶点蛋白数量越多，在网络中所处的位置越核心。

2.4GO生物功能及KEGG通路富集分析

利用DAVID数据库，对13个白果活性成分抗氧化靶点基因进行GO和KEGG功能富集分析（图4、图5），结果显示，富集的GO条目共139个，其中富集在BP的条目有101个，主要包括凋亡过程的负调控、基因表达的正调控、细胞对缺氧的反应和肝再生等；富集在CC的条目有13个，富集部位涉及大分子复合物、细胞核、核质和细胞质等；富集在MF的条目有25个，主要涉及转录因子结合、酶结合和蛋白磷酸酶结合等。KEGG通路富集分析结果显示，富集的KEGG通路有71条。白果抗氧化KEGG通路富集前20的条目主要涉及癌症、传染病、信号传导、内分泌系统和内分泌代谢疾病等几大类通路，富集的KEGG通路共71条，主要集中于癌症通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、结直肠癌、内分泌抵抗、甲状腺激素信号通路、MAPK信号通路和酒精性肝病等。

2.5白果“活性成分-核心靶点-通路”网络图构建

将核心靶点及其相关的活性成分与前20条通路及其相关靶点导入Cytoscape 3.9.1软件，删除3条重复，得到“活性成分-核心靶点-通路”网络图（图6），其中绿色菱形节点代表通路，橙色六边形代表靶点，蓝色圆形代表白果活性成分。节点大小与连接度（degree）呈正相关，利用插件CytoNCA计算网络图中成分节点的DC、BC和CC。该网络包含41个节点（包括8个化合物，13个靶点，20条通路）和152条边。从通路角度分析，连接度较高的通路为hsa05200（癌症通路）、hsa05167（卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染）和hsa05205（癌症中的蛋白多糖）等。从靶点角度分析，筛选出10个DC≥10的靶点，分别为CASP3、CCND1、MYC、CTNNB1、MAPK8、FOS、EGFR、VEGFA、IL6、ESR1。从化合物角度分析，该网络图共筛选出8种化合物，这8种化合物即为白果抗氧化的主要活性成分，分别为（-）-epigallocatechin-3-gallate（表没食子儿茶素没食子酸酯）、Quercetin（槲皮素）、beta-carotene（β-胡萝卜素）、kaempferol（山柰酚）、formononetin（芒柄花素）、isorhamnetin（异鼠李素）、beta-sitosterol（β-谷甾醇）和（+）-catechin［（+）-儿茶素］。从上述结果可以看出，化合物可以通过不同的靶点、调控不同的通路，同时也存在不同的化合物共同作用于同一靶点、调控同一通路的现象，体现了中药多成分、多靶点、多通路共同作用的特性。

2.6分子对接验证

将“活性成分-核心靶点-通路”网络图筛选出的活性成分（8个）与DC≥10的靶点（10个）进行分子对接，对接结果见图7。结合能越低说明配体和受体结合越稳定，结合能小于0说明可以自发结合，一般以结合能小于-5 kcal/mol作为评分标准[6]，结果显示，白果的主要成分与核心靶点对接结合能均小于-5 kcal/mol。说明白果主要成分和靶点都能较好的结合，结合能越低表明构象越稳定。该结果与网络药理学筛选结果相一致。利用Pymol软件将对接的最佳构象进行可视化分析。由图8可知，白果活性成分与靶点蛋白通过氢键和疏水作用力等紧密结合。图4白果抗氧化核心靶点的GO富集分析

3讨论

在正常生理状态下，机体的氧化程度和抗氧化能力维持动态平衡，氧化应激是指氧化能力和抗氧化能力之间的失衡，氧化剂作用的增强，会导致氧化还原信号传导中断或分子损伤等[7-8]。近年来研究发现，氧化应激与衰老、肿瘤、心脑血管疾病、免疫炎症疾病、糖尿病、肾脏系统疾病、阿尔兹海默病和帕金森等疾病都有密切的关系[9]。中草药和食品中含有大量的抗氧化成分，被誉为天然的抗氧化剂[10]。天然抗氧化剂的开发利用对氧化应激疾病的预防与治疗具有重要的意义。本研究借助网络药理学方法，构建“核心靶点-核心靶点相互作用”“活性成分-核心靶点-通路”等网络图。深入挖掘白果抗氧化的主要成分、核心靶点和作用机制，最后用分子对接对网络药理学结果进行验证。

3.1白果抗氧化的活性成分

基于“活性成分-核心靶点-通路”网络图的筛选，发现表没食子儿茶素没食子酸酯、槲皮素、β-胡萝卜素、山柰酚、芒柄花素、异鼠李素、β-谷甾醇和（+）-儿茶素为主要的抗氧化活性成分。大量研究表明，表没食子儿茶素没食子酸酯[11-12]、槲皮素[13]、β-胡萝卜素[14]和山柰酚[15]、芒柄花素[16]、异鼠李素[17]、β-谷甾醇[18]和（+）-儿茶素[19]均具有良好的抗氧化性。表没食子儿茶素没食子酸酯是茶多酚中生物活性最强的成分，可以通过清除活性氧，抑制细胞内生物大分子的过氧化来抑制细胞凋亡[20]，表没食子儿茶素没食子酸酯可通过调节Bcl-2家族、c-fos、c-myc、p53的基因表达来保护细胞免受高糖诱导的细胞凋亡[21]，与本研究结果相符。槲皮素是一种强抗氧化剂，是活性氧（ROS）的有效清除剂之一，槲皮素也可以通过上调内皮细胞抗氧化酶HOMX1的表达来减少氧化应激对内皮细胞的损害，从而发挥抗氧化作用[22]。